Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

Uma versão melhorada de um método para a genotipagem de espécies tóxicas pufferfish por espectrometria de massa de cromatografia / ionização por electrospray líquida (LC / ESI-MS) de reacção em cadeia da polimerase (PCR) fragmento -restriction polimorfismo de comprimento (RFLP), está descrito. a extracção do ADN é realizada utilizando um estojo de extracção de ADN à base de membrana de sílica. Após a amplificação por PCR utilizando um tampão de PCR livre de detergente, as enzimas de restrição são adicionados à solução sem purificar a solução da reacção. Uma coluna de sílica monólito de fase inversa e uma transformação de Fourier espectrómetro de massa de alta resolução com um analisador de armadilha Kingdon modificada são utilizados para a separação e detecção, respectivamente. A fase móvel, que consiste em mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol 400, trietilamina 15 mM (pH 7,9) e metanol, é entregue a um caudal de 0,4 ml / min. O tempo de ciclo para a análise / ESI-MS LC é de 8 min incluindo equilíbrio da coluna. software Deconvolution ter um isótopo modelo de distribuição of o oligonucleótido é utilizado para calcular a massa monoisotópica correspondente do espectro de massa. Para a análise de oligonucleotídeos (variação de 26-79 nucleótidos), precisão de massa foi de 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) e excelente exatidão e precisão foram mantidas por 180 horas sem o uso de um padrão de massa de bloqueio.