Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן לשימוש sheathless CE-MS ללימודי פרופיל מטבולי הוא לשימוש במעבדה בלבד. הנהלים המפורטים להלן מבוססים על 4,5 יצירה שפורסם לאחרונה. ניתן למצוא את פרטי ניסוי לעומק במסמכים אלה. לפני השימוש בפרוטוקול זה, להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS). השתמש כל נהלי הבטיחות במעבדה המתאימים, לרבות משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות, כאשר עורכי הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה. 1. הכנת פתרונות ריאגנטים דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת האלקטרוליט רקע (BGE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון BGE חדש (10% (v / v) חומצה אצטית, pH 2.2) כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9.0 מ&quot;ל של מים לתוך בקבוקון זכוכית 10 מ&quot;ל ולהוסיף 1.0 מ&quot;ל של חומצה אצטית במים במנדף. מערבבים את הפתרון ביסודיות בעזרת מערבולת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת המטבוליט standarתערובת ד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 μl של תערובת רגילה 50 מיקרומטר קטיון המכיל 60 מטבוליטים קטיוני לתוך 50 μl של מים ומערבבים הפתרון ביסודיות. חנות ב -80 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 μl של תערובת תקן אניון 50 מיקרומטר המכיל 30 מטבוליטים anionic לתוך 50 μl של מים ומערבבים הפתרון ביסודיות. אחסן את הפתרון הזה, ב aliquots כדי למנוע מחזורי הקפאה / פשרה של אותה התערובת רגילה, ב -80 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. הערה: המטבוליט תערובות תקן יציבות במשך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים כראוי ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות מקו תא גליובלסטומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את תאי U-87 MG גליובלסטומה אדם החסיד שלוש פעמים עם 1 מיליליטר פתרון נתרן כלורי 0.9% קרים כקרח 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר פתרון מתנול קר כקרח / מים (8/2, V / V) על התאים החסידים ולהתרפס באמצעות גומי הטה תא מגרד 21. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הפתרון מתנול / מים בצינור ואת ultrasonicate למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כלורופורם לשבר מתנול / מים (יחס הסופי 8/8/2, נ / V / V) ו צנטריפוגות מדגם למשך 10 דקות ב 16,100 XG ו -4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שכבת מתנול / מים להתאדות חלק זה באמצעות concentrator ואקום. מחדש את החומר היבש ב 50 מי μl לניתוח על ידי sheathless CE-MS. כאשר אינו בשימוש לאחסן את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. הגדרת מערכת Sheathless CE-MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה של המחסנית התמזג-סיליקה החשוף עם פולט הקצה הנקבובי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מחסנית התמזג-סיליקה חשוף חדש עם פולט קצה נקבובי (30 מיקרומטר אורך כולל פנימיים בקוטר x 90 סנטימטרים) במכשיר CE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לשטוף קדימה ב 50 psi במשך 15 דקות עם תוכנת שליטה על מכשיר לספירה באמצעות מתנול 100% ו חזותית לבדוק אם נוזל זורם החוצה מן capilשקע Lary במהלך שלב שטיפה זו. כמו כן לבצע שטיפה בכיוון ההפוך ב 50 psi במשך 5 דקות באמצעות פתרון BGE חזותי לבחון האם הנוזל זורם החוצה מן נימי מוליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.1.2 בלחץ של 100 psi במקרה שאין היווצרות טיפת נוזל נצפתה במוצא הנימים. התקן מחסנית התמזג-סיליקה חשוף חדשה אם אין היווצרות טיפת נוזל נצפתה במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את נימי ההפרדה עם מים ב 50 psi במשך 10 דקות, ואחריו 0.1 M NaOH ב 50 psi במשך 10 דקות, ולאחר מכן על ידי מים ב 50 psi במשך 10 דקות ולבסוף עם BGE ב 50 psi במשך 10 דקות. הערה: שלבים 2.1.1 עד 2.1.4 נדרשים רק עבור ההתקנה של מחסנית נימים חדשה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צימוד של פולט קצה הנימים הנקבובי כדי ESI-MS הערה: לפני צימוד נימי CE ל- MS, להבטיח כי המכשיר MS כבר מכויל ומחובר למערכת CE. הגדר את מתח ESI כדי0. התאימו את מכשיר MS עם מקור nanospray. גז 1 גז 2 ותנור חימום בטמפרטורה ממשק לא יושמו כפי ESI ברמות ספיקה נמוכה מאוד מתרחשת רק על ידי יישום מתח ספריי יון להגדיר ב 1500 V. סט הווילון 5 psi. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקצה המרסס של המחסנית-סיליקה התמזגה מצינור המים התקנת אותו מתאם מקור nanospray עבור צימוד למכשיר MS. ודא כי הגובה של בקבוקוני BGE במכשיר CE להתאים את גובה הטיפ המרסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק זרימת הנוזל דרך נימי מוליך על ידי שטיפה עם BGE ב 50 psi במשך 5 דקות. במהלך שטיפה זה צעד במערך ירידה בבסיס המחט מרסס ESI יש לשים לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את נימי ההפרדה עם BGE ב 50 psi במשך 10 דקות לכיוון קדימה. היווצרות Drop יש לשים לב בקצה של פולט הקצה הנקבובי (טיפ מרסס) במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את פולט הקצה הנקבובי לכניסה של כניסת MS ממרחק של גIRCA 2 עד 3 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח של 30 קילו וולט באמצעות זמן הרמפה של 1 דק &#39;ולהתחיל רכישת נתונים MS בטווח m / z מ -65 ל -1,000 מ&#39; / z ללימודי פרופיל מטבולי באמצעות הראשון מתח ESI של 0. הערה: הספקטרום מונית צריך להיות ריק אות כמו שלא צריך להיות שום electrospray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מתח ESI 1,000 V תוך להמשיך מדידת נתונים. להגביר את מתח ESI בקפיצות של 200 V עד אות רקע מתמדת הוא ציין עבור 15 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב את עמדת פולט קצה הנקבובית ביחס במרכז כניסת MS על ידי הזזת אותו x, y, או z-הכיוון כדי לראות אילו עמדה ספק המקסימאלי שניתן אות MS היציבה ביותר (electropherogram יון הכולל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אופטימיזציה של המיקום של פולט הקצה הנקבובי וקביעת מתח ESI האופטימלי, להגדיר את מתח ESI ל -0 V ולהפחית את מתח CE מ 30 קילו עד 1 קילו וולט באמצעות זמן רמפה של 5 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור usin שיטת MSg מתח ESI אופטימלית שיטה לספירה על המכשיר CE לניתוח סטנדרטים המטבוליט דגימות ביולוגיות. </li></ol></li></ol> 3. ניתוח של תקני המטבוליט ו דגימות ביולוגיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ביצועים של מערכת CE-MS sheathless <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20 μl של התערובת תקן המטבוליט anionic לתוך microvial 100 μl ריק (בקבוקון PCR) אשר נכנס לתוך בקבוקון CE ולשים בקבוקון זה במגש מדגם מפרצון. הערה: ההיקף המינימאלי הנדרש microvial עבור זריקה אמינה הוא 2 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שיטת מצב יונים שלילי רכישת MS שנוצרה במהלך השלב 2.2.9 ולאחר מכן להתחיל את רצף CE באמצעות תוכנת שליטה על המכשיר לספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את נימי הפרדה עם BGE ב 50 psi במשך 3 דקות ואחריו הזרקה ב 2.0 psi במשך 60 שניות (20 nl מתאימים 3% מנפח הנימים) ולאחר מכן על ידי הזרקת BGE ב 1.0 psi במשך 10שניות. הערה: בהמשך, MS רכישת נתונים מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח של -30 ק עם זמן רמפה של 1.0 דקות עם לחץ של 0.5 psi במשך 30 דקות ב המפרצון. לאחר הפרדה 30 דקות electrophoretic, לעצור רכישת נתונים MS ולהפחית את המתח CE ל -1 קילו וולט באמצעות זמן הרמפה של 5 דקות (ירידה הדרגתית של מתח CE לאחר הפירוד electrophoretic משפר את העמידות של פולט נימי טיפ נקבובי). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין זריקות מדגמות, יש לשטוף את הנימים עם מים, 0.1 M נתרן הידרוקסידי, מי BGE כל 30 psi במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים שנרשמו על ידי קביעת הפעמים הגירה ואת עוצמת האות של תערובת המטבוליט anionic המנותחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך אם אמות המידה המטבוליט anionic להופיע באיזור שבין 10 ו -28 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם שלושת האיזומרים הקשורות מבנית, כלומר, D- גלוקוז-1-פוספט, D- גלוקוז-6-פוספט ו- D-פרוקטוז-6-פוספט הםחלקית מופרד, כלומר, ההחלטה בין שני השיאים הראשונים היא בסביבות 0.75 ושל שני השיאים האחרונים היא בסביבות 0.50 (ראה איור 1). הערה: על-פי החלטה 1.5 מצביעה על פרדת בסיס של שתי פסגות סמוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור תערובת המטבוליט קטיוני. ודא כי זיהוי טרשת נפוצה היא כעת במצב יון חיובי ומתח CE הוא +30 ק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים שנרשמו על ידי קביעת הפעמים הגירה ואת עוצמת האות של תערובת המטבוליט קטיוני המנותחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך אם אמות המידה המטבוליט קטיוני להופיע באיזור שבין דקות 8 ו -22. בדוק אם isoleucine ו לאוצין הם נודדים בין 15 ל 15.5 דקות ולקבוע אם ההחלטה היא בסביבות 0.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דגימות ביולוגיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור פרופיל מטבולי anionic של תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה. הערה: con מטבוליתאוהל המתקבל לאחר טיפול מקדים מדגם מקביל צפיפות התאים של בסביבות 20 תאים / NL, ולכן, זריקה 20 NL הוא המקבילה של 400 תאים לכל ניתוח. . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור electropherogram יון חילוץ עבור חומצה לקטית המטבוליט (m / z 89.0243) באמצעות 5 דיוק המוני מד&quot;א לבדוק אם עוצמת האות הוא מעל 100,000 ספירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור פרופיל מטבולי קטיוני של תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה. הערה: electropherogram יון הכולל ביותר עתיר ידע יש לשים לב עבור זריקה 20 NL במצב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוחים או כאשר אינו בשימוש, יש לשטוף את הנימים עם מים ב 50 psi במשך 15 דקות ולאחסן חלק המפרצון של הנימים בתוך מים המכילים בקבוקון בסעיף הנקבובי (חלק לשקע) בצינור גם המכיל מים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+metabolomics:+strategies+to+understand+biology.">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013.">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li><li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+serum+metabolome.">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6, e16957 (2011).</li><li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li><li>Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+coverage+of+the+urinary+metabolome+by+sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84, 885-892 (2012).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+human+urine+by+CE-MS+using+a+positively+charged+capillary+coating+and+comparison+with+UPLC-MS.">Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS.</a> Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).</li><li>Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplatform+analytical+methodology+for+metabolic+fingerprinting+of+lung+tissue.">Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue.</a> Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CE/LC-MS+multiplatform+for+broad+metabolomic+analysis+of+dietary+polyphenols+effect+on+colon+cancer+cells+proliferation.">CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation.</a> Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+anionic+intermediates+for+Bacillus+subtilis+metabolic+pathways+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+(CE-ESI-MS)-based+metabolomics.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+metabolomic+workflow+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease.</a> J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+separation+science+for+metabolomics:+resolving+chemical+diversity+in+a+post-genomic+era.">New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era.</a> Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).</li><li>Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+metabolomic+investigation+of+single+neurons+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).</li><li>Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolome+analysis+based+on+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).</li><li>Maxwell, E. J., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+interface+development+for+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces:+fundamental+concepts+and+technical+developments.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li><li>Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+with+a+high-sensitivity+porous+sprayer+for+cationic+metabolome+analysis.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis.</a> Analyst. 137, 5026-5033 (2012).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+operation.+2.+Interfacing+low-flow+separation+techniques+to+mass+spectrometry+using+a+porous+tip.">Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip.</a> Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).</li><li>Dettmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+extraction+from+adherently+growing+mammalian+cells+for+metabolomics+studies:+optimization+of+harvesting+and+extraction+protocols.">Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols.</a> Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).</li></ol>

We have nothing to disclose.

שיטת sheathless CE-MS העסקת פולט קצה נקבובי הוצגה לניתוח מטבוליטים קוטב והטעון. תכונה ייחודית של גישה זו היא כי מטבוליטים anionic או קטיוני ניתן צדודית רק על ידי החלפת זיהוי הטרשת הנפוצה קוטביות CE מתח. קיים מגוון רחב של מטבוליטים קוטב וטעונים דגימות ביולוגיות ניתן לנתח עם יעילות הפרדה גבוהה, שהוא חיוני עבור מטבוליטים דומים מבני, ועם מגבלות של גילוי בטווח (הנמוך) ננו-מולר. הפרוטוקול המובא התמקד השימוש sheathless CE-MS עבור פרופיל מטבולי של תמציות התא על מנת להדגים את התועלת של השיטה עבור פרופיל מטבולי של דגימה ביולוגית. הגישה המתוארת כאן יכולה לשמש גם עבור פרופיל מטבולים של סוגים אחרים של דגימות ביולוגיות, כגון שתן אדם 5, בהתחשב בכך הליך מקדים מדגם נאות משמש. Sheathless CE-MS methoד מבוסס על פולט קצה נקבובי אשר מאפשר את השימוש של הנכס נמוך זרימת מיסודם של CE. בהקשר זה, אות ESI יציבה היא תנאי מוקדם ללימודי פרופיל מטבולי לשחזור. לפיכך, חשוב כי הקצה המרסס ממוקם כראוי מול כניסת MS. בשנת הקמה זה, תהליך ESI הוא בעיקר תלוי באופי של BGE ולכן, אופטימיזציה BGE היא קריטית. תצורת sheathless היא פחות צדדית בהשוואה למערכות נדן נוזל CE-MS שבו כל מיני יצירות נדן נוזלי ניתן להוסיף כדי לשפר את יעילות יינון. המחט מרסס ESI sheathless צריך להיות מלא לחלוטין עם נוזל מוליך (כלומר, פתרון BGE). אות ESI יציבה יכולה לנבוע נימים חלקיות או מחוברות היטב. שטיפה בלחץ גבוה עם BGE עשויה לפתור בעיה זו. אחרת נימי ההפרדה צריכה להיות מוחלפות. לפני הערכת ביצועים אנליטיים, אות רקע ESI יציבהצריך להיווצר הראשון אשר עולה בקנה אחד מ יום אחד למשנהו. המופע האנליטית של שיטת CE-MS sheathless ללימודי פרופיל מטבולי צריך להיבדק מדי יום באמצעות תערובות תקן המטבוליט. תחת אותם תנאים ניסיוניים, פעמים הגירה עקבית, כלומר, וריאציה מתחת ל -3% עבור בתוך ימים (n = 10) ובין-יום (n = 5) באמצעות הזרקת 20 nl של תערובת תקן המטבוליט (12.5 מיקרומטר), שיא גבהים / אזורים (וריאציה מתחת ל -15%) ואת מספר לוחית רישוי (הנע בין 60,000 ו 400,000) יש לקבל. מגבלות של גילוי צריכות להיות בטווח nanomolar בתקני המטבוליט ביותר. רק כאשר יתקיימו התנאים הבאים הוא השיטה מוכנה פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות. אם לא, מכשיר MS צריך להיות מכוון מחדש מכויל או פולט נימי טיפ הנקבובי צריך להיות שונה. צעד שטיפה יעיל בין CE-MS מנתח הוא בעל חשיבות גבוהה, לא רק כדילמנוע שריד פוטנציאל אלא גם כדי לשמור על ביצועי ההפרדה. שריד פוטנציאלי עשוי להיגרם על ידי בקבוקוני BGE מזוהמים המדגם ולכן לפתור על ידי החלפה עם בקבוקוני BGE חדשים. כאשר שיטת sheathless CE-MS אינה בשימוש, חשוב לנתק את נימי הפרדה לאחסן בצד המפרצון של הנימים במים מבחוץ שקוע עם שרוול ההגנה בתוך שפופרת המכילה מים להאריך חי נימים. לסיכום, שיטת CE-MS sheathless המוצע מראה פוטנציאל חזק עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות כאשר נעשה שימוש בהתאם לנהלי דיווח בפרוטוקול זה. בשלב זה, נתוני ההשוואה הבין-מעבדה נדרשים בהחלט עבור CE-MS sheathless כדי להעריך את שחזור (לטווח ארוך) וחוסנם של גישה זו עבור metabolomics. פרוטוקול זה עשוי לעורר מחקר כזה. אתגרים אנליטיים שונים עדיין צריכים להילקח בחשבון. לקבלת ביצועים זו אופטימליתormance, הזרם CE צריך להישמר רצוי מתחת ל -5 מיקרו-אמפר ובשלב זה קרינת טיפ נקבובי נימי ניתנים רק באורך של 91 ס&quot;מ אשר עשוי לעכב התפתחות של מבחני תפוקה גבוהה. יתר על כן, חיץ הפרדת pH נמוך שמש פרופיל מטבולי anionic אשר לא יכול להיות האופטימלי ביותר להשגת פרדת בסיס של פוספטים סוכר הקשורות מבני. חשוב גם הוא כי מטבוליטים anionic רק ניתן לנתח אשר (חלקית) טעונים שלילי בתנאי ההפרדה המשומשים. השלב הבא הוא להעריך את התועלת של השיטה CE-MS sheathless ללימודי פרופיל מטבולי קליניים כרגע, פולט נימי טיפ נקבובי יחיד יכול לשמש רק עבור ניתוח של עד 100 דגימות ביולוגיות. בסך הכל, התפתחות נוספת בגישה sheathless CE-MS תפתח כיוון חדש בתחום metabolomics, כלומר, לקראת הבנה עמוקה יותר של תפקודים ביולוגיים שבסעיףבמקרים בשפע-מוגבל.

בשנת metabolomics עכשווי, טכניקות הפרדה אנליטית גבוהה סוף משמשים לנתח מגוון רחב של שיעורים המטבוליט על מנת לקבל נציג לקריאה מתוך המצב הפיזיולוגי של אורגניזם 1. המטרה הסופית של מחקר metabolomics היא להשיג תשובה לשאלה ביולוגית / קלינית נתון. נכון לעכשיו, המאגר האנושי metabolome מורכב יותר מ -40,000 ערכים המטבוליט המייצגים הוא תרכובות אנדוגני אקסוגניים (את המקור האחרון מ מזין, חיידקים, סמים ממקורות אחרים) 2. בהינתן המגוון העצום פיסיקלי כימי וטווח ריכוז של מטבוליטים אלה, שיטות אנליטיות מרובות עם מנגנוני הפרדה שונים צריכות לשמש בשילוב במטרה לאפיין מטבוליטים רבים ככל האפשר בתוך דגימה ביולוגית נתונה. לדוגמה, Psychogios et al. השתמשו בשילוב של חמש טכניקות הפרדה אנליטית פרופ מטבוליתiling של נסיוב אדם וכתוצאה מכך זיהוי של יותר מ -4,000 מטבוליטים מגוונים כימי 3. במאמר זה, תשומת לב תשולם אסטרטגיות CE-MS שפותחו לאחרונה על פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות 4,5. ב CE, לייתר דיוק אלקטרופורזה אזור נימים (CZE; המכונה בדרך כלל כמו CE), תרכובות מופרדות על בסיס תשלום לגודל- שלהם היחס, ולכן שיטה אנליטית זו היא מתאימה ביותר לניתוח של מטבוליטים קוטב וטעונים. מנגנון הפרדת CE הוא שונה במהותו מן הטכניקות מבוססות chromatographic, ובכך לספק תצוגה משלים על הרכב מהטבולים של דגימות ביולוגיות 6-8. סוגה ועמיתים לעבודה היו הראשונים להציג את התועלת של CE-MS עבור פרופיל העולמי של מטבוליטים דגימות ביולוגיות 9,10. עד עכשיו, את הכדאיות והתועלת של CE-MS עבור metabolomics הודגמה 11-15 נרחב.CE מצמיד בדרך כלל MS באמצעות נוזלי נדן התממשקות טכניקת 16,17; עם זאת, עקב דילול של קולחי נימים ידי נוזל הנדן, את רגישות הזיהוי נפגעת באופן מהותי. לאחרונה, הוכיח כי שימוש ממשק sheathless שפר בצורה משמעותית את כיסוי זיהוי של מטבוליטים נוכחי דגימות ביולוגיות שונות לעומת CE-MS ניצול ממשק קלסי נדן נוזלי 5,18,19. לדוגמא, בסביבות 900 תכונות מולקולריות אותרו בשתן אנושי ידי sheathless CE-MS בעוד כ -300 תכונות מולקולריות נצפו עם 5 הנדן נוזל CE-MS. הממשק sheathless בשימוש התבסס על פולט קצה נקבובי, אשר הומצא על ידי Moini 20, המאפשר שימוש יעיל של הנכס תזרים נמוך מהותית של CE בשילוב עם ננו-ESI-MS. על מנת לעורר את השימוש sheathless CE-MS בתחום metabolomics,פרוטוקול מוצג המתאר כיצד גישה זו יכולה לשמש עבור הניתוח של מטבוליטים קוטביים מאוד דגימות ביולוגיות, כפי שהודגמה לניתוח תמציות מקו תא גליובלסטומה. הוא הראה כי שיטת CE-MS sheathless עבור הפרופיל של מטבוליטים קטיוני יכולה לשמש גם עבור הפרופיל של מטבוליטים anionic באמצעות אותו בדיוק התנאים נימי והפרדה, ובכך להפחית את זמן ניתוח ומתן פלטפורמה אנליטית אחת עבור הפרופיל העולמי של מטבוליטים טעונים. הפרוטוקול מתאר גם אסטרטגיה עבור היישור היעיל של פולט הקצה הנקבובי sheathless עם מכשיר MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

בשנת metabolomics, מגוון רחב של שיטות אנליטיות משמש הפרופיל העולמי של (אנדוגני) מטבוליטים בדגימות מורכבות. במאמר זה, פרוטוקול מוצג ניתוח של מטבוליטים anionic ו קטיוני דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסה נימי (CE-MS). CE הוא מתאים היטב בניתוח מטבוליטים קוטב וטעון כמו תרכובות מופרדות על בסיס יחס תשלום לגודל- שלהם. עיצוב ממשק sheathless שפותחו לאחרונה, כלומר, ממשק טיפ נקבובי, משמש צימוד CE כדי electrospray יינון (ESI) MS. גישה זו מאפשרת התממשקות את השימוש היעיל של נכס התזרים נמוך המהותית של CE בשילוב עם MS, וכתוצאה מכך לתחום גילוי nanomolar עבור מגוון רחב של שיעורי המטבוליט קוטב. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על העסקת נימים התמזג-סיליקה חשופה עם פולט קצה נקבובי בתנאי הפרדה הנמוכה pH לניתוח שלמגוון רחב של שיעורים המטבוליט ב דגימות ביולוגיות. הוא הוכיח כי באותו sheathless שיטת CE-MS יכול לשמש עבור פרופיל של מטבוליטים קטיוני, כולל חומצות אמינו, נוקלאוזידים ופפטידים קטנים, או מטבוליטים anionic, כולל פוספטים סוכר, נוקלאוטידים וחומצות אורגניות, על ידי רק מיתוג זיהוי טרשת נפוצה קוטביות מתח ההפרדה. מאוד פרופילי מידע עשיר מטבוליים בדגימות ביולוגיות שונות, כגון שתן, נוזל השדרתי ותמציות של הקו הסלולרי גליובלסטומה, ניתן להשיג על ידי פרוטוקול זה תוך פחות מ 1 שעות של ניתוח CE-MS.

שיטת CE-MS sheathless המוצע היא מסוגלת לספק יעיל ביותר, כלומר, את מספר לוחית רישוי החל 60,000 עד 400,000, פרופילים של מטבולית anionic ו קטיוני ב לתחום גילוי nanomolar באמצעות 10% חומצה אצטית (pH 2.2) כמו BGE. מופע הפרדת השיטה לניתוח מטבוליטים anionic הקוטביים מאוד מודגם במשך שלושה איזומרים פוספט סוכר הקשורות מבני (איור 1). למרות הפרדה ההתחלה היה לא השיג שלוש analytes אלה, הפרדה חלקית מספיק כדי לאפשר זיהוי סלקטיבית שלהם על ידי MS כמו analytes אלה יש מסה זהה בדיוק. הפוטנציאל של השיטה CE-MS sheathless עבור פרופיל מטבולי של מספר מוגבל של תאים, כלומר, זריקה 20 nl תואמת 400 תאים (צפיפות התאים הוא בסביבות 20 תאים / NL), הוא הוכיח לניתוח מטבוליטים קטיוני ב תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה (איור 2), שבו יותר מ -300 תכונות מולקולריות אותרו מעל ≥ S / N יחס 5. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> איור 1. ניתוח של איזומרים פוספט סוכר ידי sheathless CE-MS. Electropherogram יון מחולץ עבור שלושת האיזומרים פוספט סוכר (25 מיקרומטר) שהושג עם sheathless CE-MS במצב יונים שליליים. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, -30 קילו וולט (psi 0.5 להחיל על המפרצון של הנימים לספירה); הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. לשכפל באישור 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> ניתוח איור 2. של isoleucine ואניeucine ידי electropherogram יון sheathless CE-MS. שחולצו משני איזומרים חומצת אמינו (25 מיקרומטר) שהושג עם sheathless CE-MS במצב יון חיובי. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, +30 ק ו; הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> פוטנציאל איור 3. sheathless CE-MS לאפיון מטבוליטים קטיוני בתמצית שורת תאים. הפרופיל המטבולי (electropherogram יון הכולל) שנצפתה תמצית של שורת תאים גליובלסטומה עם sheathless CE-MS במצב יון חיובי. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, +30 ק ו; הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. לשכפל באישור 4 </sעד&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary Electrophoresisâ€“Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

The overall goal of this procedure is to demonstrate how capillary electrophoresis-mass spectrometry, or CE-MS, using a sheathless, porous-tip interface, can be used for the analysis of highly polar and charged metabolites. Assuming no metabolites can be often charged, and they can be cationic or anionic, and to separate them electrolitic separations like capillary electrophoresis, is the most suitable method. However, in recent years, the sensitivity was not good enough.That was due to the interfacing and the method was also not robust. But I think we nicely solved both problems using a sheath as free interface and to use this new protocol. Capillary electrophoresis-mass spectrometry using a novel sheathless porous tip interface can be used for addressing key clinical questions in the field of metabolomics.For example, the profiling of highly polar charged metabolites can be easily done with this technology. S composites separated on base of charge to size ratio. More often this technique is very suited for the profiling of this type of compounds volume labeled to biological samples.A unique feature of the proposed sheathless CE-MS methodology is that they can be used for the profiling of anionic and cationic metabolites by only switching the CE voltage polarity and the MS detection polarity. Generally people new to this method will struggle because CE-MS is considered as a relatively new and complicated technique. To begin this procedure, place a new bare fused silica cartridge with a porous tip emitter in the capillary zone electrophoresis, or CE instrument.Apply a forward methanol rinse at 50 psi for 15 minutes with the software controlling the CE instrument. And visually check whether liquid is flowing out from the capillary outlet. Then, perform a rinse in the opposite direction at 50 psi for five minutes using the background electrolite, or BGE solution, to visually examine whether liquid is flowing out from the conductive capillary.Repeat the previous step at a pressure of 100 psi in case liquid has not been observed flowing out of the capillary outlet. Next, rinse the separation capillary with water at 50 psi for 10 minutes, followed by 0.1 molar sodium hydroxide at 50 psi for 10 minutes, water at 50 psi for 10 minutes, and BGE solution at 50 psi for 10 minutes. Following this, remove the sprayer tip of the fused silica cartridge from the water tube and install it in the nanospray source adapter for coupling to the MS instrument.Ensure that the height of the BGE solution vials in the CE instrument match the height of the sprayer tip. Check for flow of liquid through the conductive capillary by rinsing with BGE solution at 50 psi for five minutes. During this rinsing step, a liquid drop at the base of the electrospray ionization, or ESI sprayer needle, should be observed.After rinsing, flush the separation capillary with BGE solution at 50 psi for 10 minutes in the forward direction. A liquid drop should be observed at the tip of the porous tip emitter during this step. Now, position the porous tip emitter to the entrance of the MS inlet at an approximate distance of two to three mm.Apply a voltage of 30 kV using a ramp time of one minute and start acquiring MS data in the mass-to-charge range from 65 to 1000 for metabolic profiling studies using first an ESI voltage of zero. Set the ESI voltage to 1000 V while measuring the data. Increase the ESI voltage with increments of 200 V until a constant background signal is observed for at least 15 minutes.Transfer 20 microliters of a previously prepared anionic metabolite standard mixture into an empty 100 microliter microvial. Place the microvial in a CE vial, and place the CE vial in the inlet sample tray. Start a previously created MS acquisition negative ion mode method, and subsequently start the CE sequence using the software controlling the CE instrument.Following this, rinse the separation capillary with BGE solution at 50 psi for three minutes, followed by injections at two psi for 60 seconds and one psi for 10 seconds. Apply a voltage of 30 kV with a ramp time of one minute and a pressure of 0.5 psi for 30 minutes at the inlet. After a 30 minute electophoretic separation, stop MS data acquisition and decrease the CE voltage to 1 kV using a ramp time of five minutes.Between sample injections, rinse the separation capillary with water, 0.1 molar sodium hydroxide, water, and BGE solution at 30 psi for three minutes. Once the runs are complete, analyze the recorded data by determining the migration times and the signal intensity of the analyzed anionic metabolite mixture. Assess whether the anionic metabolite standards appear in the region between 10 and 28 minutes.Then, check whether the three structurally related isomers, D-glucose 1-phosphate, D-glucose 6-phosphate, and D-fructose 6-phosphate, are partially separated. The separation performance of the sheathless CE-MS method for the analysis of highly polar anionic metabolites is demonstrated for three structurally related sugar phosphate isomers. Though a baseline separation was not obtained for these three analytes, a partial separation is sufficient to allow their selective detection by MS, as these analytes have the same exact mass.When analyzing biological samples, with this sheathless CE-MS methodology, it is important to regularly check the analytical performance over time using academic standards. Overall, the sheathless methodology allows the profiling of these type of compounds in ultra small biological samples, thereby opening up a lot of possibilities for analyzing these type of samples in the biomedical sciences fields, bioanalytical chemistry fields, and research areas outside. After watching this video, you should have a good understanding of how to couple CE to MS via a sheathless porous interface for the profiling of highly polar and charged metabolites.