Abstract
Biochemistry
Hyperpolarisations-aktivierte cyclische Nukleotid-gesteuerten (HCN) Kanäle ubiquitär im Gehirn exprimiert wird, wo sie dazu dienen, die Erregbarkeit von Neuronen zu regulieren. Die subzelluläre Verteilung dieser Kanäle in Pyramidenneuronen des Hippocampus CA1 wird von Tetratricopeptid repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), eine Hilfsuntereinheit geregelt. Genetische Knockout von HCN porenbildenden Untereinheiten oder TRIP8b, beide führen zu einem Anstieg der Antidepressiva-ähnliche Verhalten, was darauf hindeutet, dass die Funktion der HCN-Kanäle zu begrenzen als Behandlung nützlich sein können für Major Depressive Disorder (MDD). Trotz erheblicher therapeutischen Interesse sind HCN-Kanäle auch im Herz, wo sie Rhythmik regulieren. off-target Probleme mit blockierenden kardialen HCN Kanälen unserem Labor wurde das Targeting Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b um kürzlich assoziiert zu umgehen vorgeschlagen, um spezifisch HCN Kanalfunktion im Gehirn stören.TRIP8b bindet an HCN Porenuntereinheiten an zwei verschiedene Wechselwirkungsstellen bilden, wobei hier die Konzentration auf die Wechselwirkung zwischen dem tetratricopeptide repeat (TPR) Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Schwanz von HCN1 ist. In diesem Protokoll eine erweiterte Beschreibung eines Verfahrens zur Reinigung von TRIP8b und einen hohen Durchsatz Bildschirm zu identifizieren niedermolekularen Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b Ausführung beschrieben. Das Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening verwendet eine Fluoreszenzpolarisation (FP) -basierte Assay die Bindung eines großen TRIP8b Fragment mit einem Fluorophor-markierten elf Aminosäuren langes Peptid entsprechend dem C HCN1 terminalen Schwanz zu überwachen. Diese Methode erlaubt "Treffer" Verbindungen in der Polarisation des emittierten Lichts identifiziert basierend auf der Änderung werden. Validierungstests werden dann vorgenommen, um sicherzustellen, dass "Hit" Verbindungen sind nicht artifactual.
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