Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Özet

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Özet

Otoimmün hastalıklar nedeniyle immünolojik kendine karşı direncini kaybı ortaya çıkar. Düzenleme T hücreleri (Tregs) immünolojik kendine karşı direncini önemli aracılarıdır. Periferik kanda dolaşan Tregs% 2 - yaklaşık 1 ile farelerde ve insanlarda olgun CD4 ⁺ T hücre alt-popülasyonu% 10 - Tregs yaklaşık 5 temsil etmektedir. Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) potansiyel oto-bağışıklık hastalıkları, hücre bazlı terapiler için kullanılacak sahip fonksiyonel Tregs içine ayırt edilebilir. Burada, iPSCs gelen antijen (Ag) 'e özgü Tregs (yani, iPSC-Treg'ler) geliştirmek için bir yöntem mevcut. yöntem iPSCs olarak transkripsiyon faktörü Foxp3 ve Ag-spesifik T hücresi reseptörü (TCR) içeren ve Çentik ifade OP9 stromal hücreleri üzerinde farklılaşan göre delta-benzeri (DL) 1 ve DL4 ligandları. In vitro farklılaştırma ardından, iPSC-Treg'ler CD4, CD8, CD3, CD25, Foxp3 ve Ag-spesifik TCR ifade Ag uyarısına cevap verebilmektedir.Bu yöntem, başarılı bir murin modelinde otoimmün artrit, hücre bazlı tedavi uygulanmıştır. Ag-teşvikli artrit (AIA) tohumlu zeytin farelere bu Ag-spesifik iPSC-Tregs adoptif nakli eklem iltihabı azaltmak ve şişme ve kemik kaybını önlemek için yeteneğine sahiptir.

Giriş

Autoimmune arthritis is a systemic disease characterized by hyperplasia of synovial tissue and progressive destruction of articular cartilage, bone, and ligaments¹. The defective generation or function of Tregs in autoimmune arthritis contributes to chronic inflammation and tissue injury because Tregs play a crucial role in preventing the development of auto-reactive immune cells.

Manipulation of Tregs is an ideal strategy for the development of therapies to suppress inflammation in an Ag-dependent manner. For Treg-based immunotherapy, the specificity of the transferred Tregs is important for the treatment of ongoing autoimmunity². To exhibit the suppressive activity, Tregs need to migrate and be retained at the afflicted region, which can be directed by the specificity of the TCR for the Ag at that location³. Although polyclonal Tregs may contain a small population containing this Ag specificity from their TCRs, the numbers of these Ag-specific Tregs are usually low. Consequently, cell-based therapies using polyclonal Tregs against autoimmune disorders require adoptive transfers of a large number of Tregs^4,5. Because pluripotent stem cells (PSCs) have the ability to develop into any type of cell, Ag-specific PSC-Tregs may prove to be good candidates for Treg-based immunotherapy. Previous studies have shown the successful development of PSC-derived T cells, including Tregs^6-8.

Here, we describe a protocol to develop Ag-specific iPSC-Tregs. We further describe a cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model using such Tregs. This method is based upon genetically modifying murine iPSCs with Ag-specific TCRs and the transcriptional factor FoxP3. The engineered iPSCs then differentiate into Ag-specific Tregs on the OP9 stromal cells expressing Notch ligands DL1, DL4, and MHC-II (I-A^b) molecules in the presence of cytokines mFlt3L and mIL-7. These Ag-specific iPSC-Tregs can produce suppressive cytokines, such as TGF-β and IL-10, when stimulated with the Ag, and adoptive transfer of such Tregs has the ability to suppress AIA development in a murine model. The described protocol can be used to develop stem cell-derived Ag-specific Tregs for potential therapeutic interventions.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Tıp Hayvan Bakım Komitesi Pennsylvania State Üniversitesi (IACUC protokolü # 45470) tarafından onaylanır ve Laboratuar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği kurallarına uygun olarak yapılmaktadır.

1. Kök Hücre Kültürü

1. kaplamak için 37 ° C (kuluçka) en az 30 dakika boyunca% 0.1 jelatin, 10 ml plakası olan bir 10 cm tabak inkübe edin.
2. Çanak ve levha 3 x 10 ⁶ jelatinin çıkarın SNL76 / 7 hücreleri ışımaya tutulmuş ve% 10 DMEM ortamı (% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin) kullanılarak, 37 ° C'de (kuluçka) bir gün boyunca inkübe edilir.
3. iPSC ortam kullanılarak SNL76 / 7 hücre besleyici tabakası üzerine levha ve Kültür çözülmüş iPSCs ortamı çıkarın (% 15 fetal buzağı serumu, 0.1 mmol / L esansiyel olmayan amino asitler, 1 mmol / L L-glutamin içeren DMEM ortamı ve 0.1 mg / L β-merkaptoetanol) ^9. Fare iPS-MEF-Ng-20D-17 hücre liOct3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-Myc retro virüs transfeksiyonu fare embriyonik fibroblastlar indüklenen edildi, NE Dr. Shinya Yamanaka (Frontier Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Kyoto Üniversitesi, Kyoto, Japonya) elde edildi.
4. Taze medya ile günde 3 ortamı değiştirmek ve mikroskop altında iPSC koloniler gözlemlemek.
   NOT: Bu koloniler az parlak küme veya bir floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonu gösteren açık bir sınır yuvarlak hücrelerdir.

Ag-spesifik iPSC-Tregs Vitro Farklılaşma 2.

1. Yapıları oluşturmak MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3 bir yapı oluşturmak için kendi kendine-yaran peptid 2A bağlantılı MIDR plazmid ^10'a alt klonlama OT-II TCR genlerinin ve Foxp3 tarafından Retroviral transdüksiyonun kullanılmak üzere.
2. Paketleme hücre hattı olarak Plat E hücreleri kullanılarak iPSCs retroviral transdüksiyonunu ⁹ gerçekleştirin.
3. 0. günde, tohum PÇ9-DL1-DL4-IA ^B hücreleri% 20 FCS ve 2.2 g / L sodyum bikarbonat kompozisyonuna sahiptir. Levha 10 cm tabak başına 1 x 10 ⁶ hücre ihtiva eden OP-9 ortam (α-MEM ortamı kullanılarak 10 ⁴ hücre / ^cm2 ta asgari yoğunluk.
4. OP9-DL1-DL4-IA ^b hücreleri% 80-90 konfluent olunca günde 3, medyayı çıkarın ve 0,5 tohum - OP9-DL1-DL4 üzerinde 1 x 10 ⁵ iPSCs - IA ^b hücreleri PÇ-9 medyada.
   NOT: Bu PÇ9-DL1-DL4-IA ^B hücreleri üzerindeki iPSCs ko-kültür kurar ve farklılaşma ⁹ gün 0 olarak kabul edilir.
5. günde 5 günü, aspirasyon ile 10 cm çanak ortamı çıkarın 1x 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın ve PBS aspire. % 0.25 tripsin 4 ml ilave edilir ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de, hücrelere iPSC başka bir medya 8 ml ilave bunları yeniden askıya ve santrifüjlenir.
   1. Aspire süpernatan ve iPSC ortam, 10 ml hücrelerin yeniden askıya. taze bir 10 cm çanak bu yeniden askıya hücreleri inkübeve 30 dakika boyunca inkübatör dönmek.
      NOT: OP9-DL1-DL4-IA ^b besleyici hücreler çıkarın ve medya yüzen ayırt iPSCs tutun. Daha fazla ko-kültür için% 90 confluency - Bakım OP9-DL1-DL4-IA ^b hücreleri sürekli 80 elde etmek.
   2. 30 dakika sonra, yüzen hücreleri toplamak 70 mikron hücre süzgecinden bunları filtre ve bir hemasitometre hücreleri saymak.
6. OP9 medya PÇ9-DL1-DL4-IA ^B hücreleri% 90 konfluent - yeni bir 80 Tohum iPSCs 5 x 10 ^5. 5 ng / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda mFlt-3L ile ortam ilavesi.
7. 8. günde, 10 ml pipet kullanarak çanak kendisinden ortam ile plakayı yıkayarak kısmen farklılaşmış iPSCs toplar. çanak alt OP9 tek tabaka kırmak için değil böylece nazikçe dikkatli, güçlü pipetleme yarı yapışık hücrelere yıkayın çanak PÇ-9 medya başka bir 5 ml kullanın. tüm yarı reklam hasat 10 ml PBS ile tekrar kullanınherent hücreleri farklılaştırarak.
   1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de iki yıkama, santrifüj birleştirin, mFlt-3L (5 ng / ml) ve mlL-7 (1 ng / ml) ihtiva eden OP9, 10 mL ortam içerisinde yeniden askıya ve 70 vasıtasıyla filtre edin mikron hücre süzgeç.
8. Aşama 1.1'de olduğu gibi, ^B hücreleri% 90 konfluent PÇ9-DL1-DL4-Ia - 80 ihtiva eden bir 6-yuvalı kültür plakasına hücreleri aktarın. Aktarım hücreler 6 oyuklu plakanın bir oyuk içine bir 10 cm tabak hasat.
9. 10. günde, mFlt-3L (5 ng / ml) ve mlL-7 (1 ng / ml) ile desteklenmiş taze OP9 ortamına hücrelerden ortam değişikliği yarısı. iki günde bu adımı yineleyin.
10. 4-6 gün büyümeye bağlı olarak, yeniden ekim adım 1.1 de tarif edildiği gibi PÇ9-DL1-DL4-IA ^B hücrelerinin yeni bir katman ile plakalar üzerine ayırt iPSCs.

İn Vitro Treg farklılaşması ve olgunlaşmasının 3. Değerlendirme

1. ayırt iPSCs morfolojik değişiklikler.
   1. MoNITOR gün geleneksel bir aydınlık mikroskobu (20X) kapsamında, canlı hücreleri gözlemleyerek PÇ9-DL1-DL4-IA ^B hücreleri ile iPSCs ko-kültür. 5. günde, bu düzleştirilmiş hücreleri gibi mezoderm benzeri özelliklere sahip, kolonilerin. günde 8 ile, ayırt hücreleri temsil hücrelerin küçük, yuvarlak kümeleri, gözlemlemek.
   2. Canlı hücrelerin sayısını ve yüzdesini saptamak üzere hücreleri saymak için Tripan Mavisi Dışlama yöntemi kullanın. hemasitometre dört ızgaraları içindeki hücrelerin sayısına bölünmesiyle canlı hücre sayısı hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması. Hücreler tripan mavisi kadar alırsak, onları ölü ya da cansız düşünün. kültürden hasat canlı hücre sayısı kaydedilir.
2. iPSCs ayırt Flow sitometri analizi.
   1. gün 5, 7, 11, 15, 19, 21 ve eş-kültür, 28, adım 25'te,% 0.25 tripsin ile hücreleri çıkarmak.
   2. Farklı florokrom-eşlenik antikorlar yüzey boyama öncesinde, incubatE 20 dakika boyunca 4 ° C'de PBS (nihai konsantrasyon 10 ug / mL) içinde seyreltilmiş Fc bloke edici 2.4G2 100 ul 1 x 10 ⁶ hücre, hücre yüzeyi üzerinde Fc reseptörüne antikorun önler.
   3. Gün 5, 7, 11, 15, 19, 21, ve 28, CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25 dahil olmak üzere hücre yüzeyi işaretçileri, tespit etmek için farklı bir florokrom-eşlenik antikorlar ile akış sitometrisi için 1 x 10 ⁶ hücre kullanın ve CTLA4.
   4. Fc Block sonra, 4 ° C'de 20 dakika süreyle, farklı florokrom-eşlenik antikorlar ile 10 ml PBS ve leke hücreleri yıkayın ve daha sonra akış sitometresi 15 renk akış sitometrik analizi gerçekleştirmek. 100 ul PBS içinde seyreltilmiş 10 ⁶ hücre başına antikor 0.200 ug kullanın.
   5. 28 günde, CD4 ve CD8 florokrom-eşlenik lekeleme kullanılarak CD4 ^+, CD8 ⁺ hücreleri üzerinde ¹¹ akış sitometrisi ve kapının hücreleri analiz; TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA ifadesi için analiz-4 Ve FoxP3 (Şekil 1). FoxP3 boyama, hücrelerin düzeltmek ve onları permealize ve sonra antikor boyama ¹¹ gerçekleştirin.
3. IPSCs in vitro antijen ile uyarılması.
   1. yüzen hücreleri toplayarak kültürlerden ko-kültür, hasat iPSC-Treg'ler gününde 28. (Adım 2.5 gibi),% 0.25 tripsin ile hücrelerin geri kalanı tripsinize ve iPSC ortam 8 ml hücrelerin yeniden askıya. Oda sıcaklığında 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje, ortam, 10 ml hücreleri askıya tekrar tekrar ortamı aspire ve.
      1. 30 dakika boyunca 37 ° C 'de, yeni bir 10 cm'lik bir tabakta yeniden süspansiyon haline hücreleri inkübe ve kayan hücreleri toplamak. soğuk PBS ile hücreleri yıkayın.
   2. 96 oyuklu bir plaka ^11, 30 dakika boyunca 4 ° C 'de ortam 200 ul 5 uM ovalbümin peptidi ile farelerin (OVA _323-339) - / - C57BL / 6 Rag1 dalaklarından 3 x 10 ⁶ splenositlerin inkübe edin.
   3. OVA _323-339 ile Tregs Mix -pulsed 1 at splenositler: 4 oranında (0.75 x 10 ⁶ Tregs kullanın). 40 saat bir _CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edilir. Son 4 saat içinde, kültür (1 x kültür ortamı içinde seyreltilmiş, gerçek konsantrasyon 1,000x) seyreltilir Brefeldin A 4 ul ekle.
   4. (Adım 2.5 gibi),% 0.25 tripsin ile hasat hücreleri seyreltildi (nihai konsantrasyon 10 ug / ml) Fc engelleyici 2.4G2 ve leke, 100 ul% 10 _NaN3 ve 0.5 M EDTA çözeltisi (FACS tamponu), blok ile yıkayın adımda 3.2.3-3.2.4 gibi yüzey belirteçleri, CD4, CD8, TCRVα2 ve TCRVβ5 için.
   5. PBS içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi hücreleri saptamak ve hücre yüzeyi boyama sonrası 1x permeabilizasyon tamponu 100 ul geçirgenliği. Dikkat! Paraformaldehit alerjik karsinojenik ve toksik değildir.
   6. florokrom-eşlenik TGF-p ve IL-10, karanlıkta 20 dakika için hücrelerin lekelenmesi. Antikor 0.200 ug / 10 ⁶ hücre kullan olduğu zaman dilüe olabilme100 ul PBS ed. 15-renkli akım sitometresi (Şekil 2), TGF-p ve IL-10 nin intraselüler üretimini algılar.
   7. Akım sitometri analizi ¹¹ öncesinde soğuk FACS tamponu ile hücreler üç kez yıkayın.
4. Ag-spesifik iPSC-Tregs in vivo ısrarında bir.
   1. PÇ9-DL1-DL4-IA ^B hücreleri üzerinde eş-kültür 8 gün sonra transfer iPSC türevi ön-Tregs VIA adım Thy 1.1 konjenik farelere 3.3.1 (4-6 haftalık) 'de (Thy1.2) anestezi olmadan kuyruk ven enjeksiyon. kuyruk damarından gerçekleştirmeden önce, 5 dakika boyunca bir kızıl ötesi lamba kullanılarak kuyruk damarının dilate. Kuyruk veni dilatasyon sonra, süzgeç fare ve adoptif dip damar yoluyla enjekte edilerek 200 ul PBS içinde yeniden süspansiyona alınmış, 3 x 10 ⁶ hücre yerleştirin.
   2. Altı hafta Treg transferi sonrasında, servikal dislokasyon tarafından takip CO ₂ boğulma tarafından fareler euthanize. mil emin olunce nefes değildir. periton boşluğunu çevreleyen iç cildi açığa çıkarmak için geri çekerek hafifçe makas ve forseps kullanarak periton dış kabuğunu kesip tarafından periton boşluğuna açın. dalak ve enjekte Thy 1.1 congenic farelerin periferal lenf düğümleri izole edin.
   3. tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere mekanik olarak parçalanması ile dalak ve lenf düğümleri hücreleri toplamak. Kırmızı kan hücreleri lize etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ACK lisiz tamponu, 5 ml kuluçkaya bırakılır. Toplamak ve soğuk FACS tamponu, 10 ml kalan splenositlerin veya lenfositlerle yıkayın.
   4. Yıkamanın ardından, seyreltilmiş florokrom-eşlenik anti-Thy 1.2 antikor 100 ul ile adım 3.2.2 ve leke olarak 20 dakika süre ile 4 ° C 'de Fc bloke edici 2.4G2 hücreleri tedavi.
   5. FACS tampon 10 ml hücreleri yıkayın ve sitometrik analizi ¹¹ akmaya devam edin.

Otoimmün Artrit Vivo Olgunlaşma 4. ve Bastırma

1. Adım 2.1 gibi yapıları oluşturmak.
2. Adım 2.2 olarak retroviral transdüksiyon ⁹ gerçekleştirin.
3. In vivo farklılaşması ve farelerde artirit indüksiyonu in.
   1. OT-II TCR / FoxP3 transduced iPSCs (OT-II-FoxP3 / iPSCs) ayırt sitokinler mFlt-3L varlığında OP9-DL1-DL4-IA ^b stromal hücreleri üzerinde FoxP3 transduced iPSCs ve DsRed transduced iPSCs ve 2.6 - mIL-7 8 gün boyunca adımlarda 2.1 açıklandığı gibi.
   2. Trypisinize 10 cm plaka ve hücreleri üç çeşit taze ortam 10 ml her biri 10 cm plaka hücrelerin yeniden askıya. taze 10 cm plaka hücreleri ekleyin ve 30 dakika için inkübatöre geri döner. 30 dakika sonra, hücrelerin yüzer toplayın.
   3. hücre kümeleri kaldırmak ve hemasitometre kullanarak saymak için 70 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçmektedir. Soğuk PBS 1.5 x 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar hücrelere ayarlamak ve gerektiğinde tekrar filtre. farelere evlatlık hücre transferi kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
   4. 3.4.1 de tarif edildiği gibi bir kuyruk damarı yoluyla 6 haftalık dişi C57BL / 6 fareleri - 4, üç farklı grup hücre süspansiyonu 200 ul (3 x 10 ⁶ hücre) enjekte
   5. hücre transferi 10 gün sonra, MBSA'ın ug 1 ml şırınga ile kuyruk tabanında Freund tam adjuvanı içinde emülsiyon haline getirilmiş 100 ile fareler enjekte edilir.
   6. 17. günde bir izofluran buharlaştırıcı (IACUC kurallarına göre) kullanarak fareler uyutmak. indüksiyonu için% 5 izofluran ve 1 - - bakım için% 2 4 kullanmaktadır. Sağ diz ekleminde 10 ul PBS içinde 20 ug MBSA ve 100 ug tam OVA ortak sol dizinde ve 10 ul PBS içinde 20 ug MBSA'ın intraartiküler enjeksiyon ile arteritin uyarılması. artrit geliştirmiştir sonra gıda ve gelpack yatak zemin üzerine yerleştirilebilir. 2/5 veya can çekişen, şiddetli kaşeksi ve / veya kalıcı yatma (24 saatlik süresi) Kondüsyon Skoru (BCS), ve şiddet skoru ise 4. skor: Fareler ötenazi edilecek4, eritem ve şiddetli şişme ayak bileği, ayak ve rakam ya da ekstremite ankyloses kapsamaktadır.
4. OT-II TCR / FoxP3 transduced iPSCs karakterizasyonu.
   1. Sabitlenmemiş canlı DsRed ⁺ GFP ⁺ hücreleri görselleştirmek için bir floresan mikroskop (20X) kullanın.
   2. Her iki Western Blot ile gen entegrasyonu ve ifadesini incelemek ve ¹¹ akım sitometri.
5. Treg gelişimi ve olgunlaşma.
   1. 2, 4, ve 6 hücre transferinden sonra, farelere ötenazi. İlk aşamada CO ₂ 2 l - ötenazi için, her bir kafeste 1 kullanın. / Dk 5 L - hayvan bilincini kaybetti sonra, 4 CO ₂ akış hızını artırır. CO ₂ inhalasyon yoluyla fareler Euthanize. dalak izole edin ve periton boşluğunu çevreleyen iç cildi açığa çıkarmak için geri çekerek hafifçe makas ve forseps kullanarak periton dış kabuğunu kesme ve lenf düğümleri boşaltın.
   2. tek bir hücre süspansiyonu f toplayınROM hücre süzgecinden ve% 1 iPSC ortam içinde 1 ml hava ile mekanik arıza ile dalak ve lenf düğümleri. 5 dakika boyunca 400 g'de ortamı ihtiva eden konik tüp santrifüjleyin. kırmızı kan hücrelerinin lize ACK lisiz tamponu, 5 ml hücre pelletini yeniden askıya. Yeniden santrifüj 5 dakika için 1000 rpm'de. Hücre pelet yeniden askıya ve soğuk FACS tamponu ile kalan splenositlerin veya lenfositler yıkayın. adımları 3.4.4 izleyin - 3.4.5 ve flow sitometri yöntemi geçin.
6. Hücre içi boyama.
   1. Gün 50 sonrası meydan, dalak izole ve CO euthanization sonra (adım 4.5.1 gibi) servikal dislokasyon ardından ₂ inhalasyon farelerin lenf düğümleri boşaltın.
   2. bir hücre süzgeç ve 1 ml hava ile mekanik arıza ile dalak ve lenf düğümleri tek bir hücre süspansiyonu toplanır. kırmızı kan hücrelerinin lize ACK lisiz tamponu, 5 ml, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında splenositlerin inkübe edin. Toplamak ve kalan s yıkayınsoğuk FACS tamponu ile plenocytes veya lenfositler. Yüzey belirteçleri CD4, CD8, CD25 ve TCRVβ5 ile 3.2.4, ama leke - adımlarını 3.2.3 izleyin.
   3. 3.3.7 canlı CD4 ⁺ CD25 ⁺ hücreleri üzerinde hücre içi sitokin üretimini (TGF-p ve IL-10) iPSC türetilmiş Tregs ve kapı analizi - 3.3.5 de tarif edildiği gibi hücre içi boyama hücreleri düzeltmek için devam edin.
7. dizlerde Ag-spesifik Tregs Sızma ve artrit bastırılması.
   1. 7 gün - adımlar (4.3.6 4.3) - Aşağıdaki 14 sonrası artrit indüksiyon, (IACUC kurallarına göre) CO servikal dislokasyon tarafından takip ₂ inhalasyon fareler euthanize. elektrikli kesme makinesi ile diz saç çıkarın ve cerrahi prosedür ile dizlerini tüketim.
   2. künt uç makasla arka bacağında bir kesi yaparak bacak deri kaldırmak ve ayak bileği için uyluk boyunca ve aşağı deriyi kesti. Yavaşça kas maruz bacak ve ayak üstü cilt soyma. Kaldırdikkatle diz eklemini zarar vermeden bacak kas.
      1. sadece pelvik / kalça eklemi üzerinde arka bacak kesin ve keskin diseksiyon makas kullanarak tibia kesti.
   3. 48 saat süreyle% 4 formalin dizlerini sabitleyin. 2.5 M formik asit ile diz kirecini; % 95 etanol içerisinde iki kez yıkayın,% 100 etanol içinde iki kez yıkayın, 3 dakika boyunca ksilen içinde üç kez yıkayın 2 dakika boyunca iyonu giderilmiş suda iki kez yıkayın ve 1 mM EDTA içinde kirecini. 20 dakika boyunca bir alt kaynama sıcaklığı (90 ° C) tedavi edin.
   4. 30 dakika süre ile sabit bir doku soğutun. 4 dakika süreyle 1x PBS ile durulayın ve parafin gömün. su yerinden, ve sonra balmumu ile sızmak için etanol banyoları bir dizi dokuları dehydrate. Sonra mum bloklar halinde sızmış doku embed. boyama için dikey ve yatay bölümlendirilmeleri gerçekleştirin. bir kayar mikrotom ile 4 um kesitler hazırlamak.
   5. deparaffi standart prosedürlerinden sonra bölümlerde immunofluorescent boyama gerçekleştirinzasyon ve rehidrasyon ksilen ve etanol ¹² kullanılmıştır.
   6. Ag alma sonra 3 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit çözeltisinin yeterli bir miktarı slayt daldırarak bir endojen peroksidaz etkinliğini bloke eder. 60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, oda sıcaklığında PBS içinde% 3 BSA içinde spesifik olmayan bağlanma için blok kayar.
   7. bloke çözeltisi içinde 1: 100 seyreltilmiş florokrom-eşlenik TCRVβ5 antikoru 200 ul Leke bölümleri. 75, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe -% 100 nemli bir bölmede, ve 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde 5 kez yıkayın.
   8. DAPI içeren bir antifade bir reaktif ile nükleer boyama için slaytlar karşıt. Tüm lamel kaplı olduğunu belli hale lamel seyreltilmiş DAPI boyama çözeltisi (1x PBS içinde 300 nM) yaklaşık 300 ul ekleyin. Bir floresan mikroskobu (Şekil 3) altında analize kadar 4 ° C'de karanlıkta slaytlar saklayın.
8. Artrit bastırma tahlil
   1. bir temel kurmak için çevirmeli ayar kumpas kullanarak artrit indüksiyon öncesi farelerin iki diz şişmesi ölçün.
   2. artrit indüksiyon ve Treg transferi için - adımlar (4.3.6 4.3) izleyin. Çevirmeli ayar kumpas sonrası Treg transferi ile fare dizler ölçün.
   3. Diz çapı oranında artış hesaplayın: Yüzde Artış = (Diz çapı günde 1 - 0. günde Diz çapı) / 0. günde Diz çapı.
9. Histoloji dizlerde eklem harabiyeti ve inflamatuar hücre infiltrasyonu Ölçümü (Şekil 4).
   1. 7 gün sonra artrit indüklendikten, daha önce tarif edildiği gibi fare euthanize ve cerrahi prosedür ile diz tüketim. 4.7.2 - adımı 4.7.1 bakın.
   2. % 4 formalin dizlerini Fix EDTA kirecini ve parafin içine gömmek. adım 4.7.3 bakın
   3. % 10 formalin içinde düzeltmek, hem de dizlerini kaldırmak ve Formical-4 calcify. 4 mikron Parafin, bölüm dokuları gömmek ve hematoxyl ile lekeve eozin (H & E) ya da (aşama 4.7.7 gibi) Safranin O boyama ve bir mikroskop altında gözleyin.
   4. yarı kantitatif puanlama sistemi ile kemik erozyonu değerlendirmek için H & E boyama kullanın (0: hayır erozyonlar; 4: genişletilmiş erozyonlar ve kemik yıkımını). proteoglikan kaybı değerlendirmek ve yarı-kantitatif puanlama sistemi ile puan Safranin O boyama kullanın (0: proteoglikan kaybı; 3: proteoglikan için boyama tam kaybı).
      1. H & E lekeli slaytlar üzerinde inflamatuar hücre infiltrasyonu gol yarı kantitatif puanlama sistemini kullanın (: hayır hücre infiltrasyonu; 4: 0 hücre infiltrasyonu abounded). bir kör bir şekilde iki diz inceleyerek puanları değerlendirin.

Yüksek çözünürlüklü Mikro bilgisayarlı Tomografi (mikro-CT) Sistemi ile Dizler Kemik Kaybının 5. Ölçüm

1. gün 10 sonrası artrit indüksiyon,% 2 izofluran ile Fareler uyuşturan ve görüntüleme için hazırlar.
2. Pozisyon mikrofonodasında yukarı bakacak şekilde dizlerinin e.
3. Farelerin dizlerinin çevresindeki kemik mimarisinin in vivo görüntüleme elde etmek için yüksek çözünürlüklü bir mikro-BT sistemini kullanın.
4. 55 kv 10.5 mikron voksel boyutu, 145 uA 200 msn entegrasyon süresi, 211 resim: aşağıdaki parametrelerle fare diz eklemleri de dahil olmak üzere bir 2.2 mm uzunluğunda olan mikro-BT taramaları, gerçekleştirin.
5. Daha fazla görüntü işleme (volume rendering ve transformasyon) (Şekil 5) sonra ithalat mikro-BT görüntüleri ve yakalama frontal düzlem görüntüler.

Sonuçlar

28. günde, burada gösterildiği gibi, Ag-spesifik Tregs esas CD3 ve Ag-spesifik TCR iki T hücre işaretçileri olarak ifade edilmiştir. CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ popülasyonu CD4 ifade edilmiştir. Tipik olarak, doğal olarak T _regs (nTregs üretme) meydana gelen ve ektopik Foxp3 T hücrelerinde yüksek seviyelerde ifade edilmiştir, aynı zamanda CD25, CD127, ve CTLA-4 olarak ifade CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ CD4 ⁺ hücrelerinin, çoğu. A...

Tartışmalar

Bu protokol, kritik bir adımdır TCR / FoxP3 gen transduced iPSCs in vitro farklılaştırma olduğunu. In vitro Notch sinyal T hücre soyu doğru gelişimini uyarmaktadır. CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ Tregs içine iPSCs ayırt etmek, biz OP9-DL1 / DL4 / IA ^b hücreleri, son derece hızlı MHC II (IA ^b) molekülleri kullanılır. IPSCs çoğu CD4 ⁺ hücreleri içinde farklılık gösterir. Ancak, yüzey TCR ifade sonrasında, pek çok farklı ön T hücreleri a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6j mice	Jackson Laboratory	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	2216
Anti-CD3 (2C11) antibody	BD Pharmingen	553058
Anti-CD28 (37.51) antibody	BD Pharmingen	553295
Anti-CD4 (GK1.5) antibody	Biolegend	100417
Anti-CD8 (53–6.7) antibody	Biolegend	100714
Anti-CD25 (3C7) antibody	Biolegend	101912
Anti-TCR-β (H57597) antibody	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Integrated science	204130
ACK Lysis buffer	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
Gelatin	Sigma	G9391
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Permeabilization buffer	Biolegend	421002
mBSA	Sigma	A7906
Ova albumin	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Tailveiner restrainer	Braintree scientific	RTV 150-STD