细胞系标记的共定位和番茄信号

摘要

我们制定了两套在ROSA26 ^tdtomato（在所有细胞中广泛表达）/ Cre重组（特别是软骨细胞表达）小鼠跟踪组合：一个2.3Col1a1-GFP（具体以成骨细胞）和一个与免疫（具体以骨细胞）。该数据证明软骨细胞的直接转化成骨细胞。

摘要

细胞谱系追踪系统已在发育生物学研究中主要使用。利用Cre重组酶的允许记者在特定细胞系和所有后代的活化。在这里，我们使用的细胞谱系追踪技术来证明软骨细胞长骨以及使用2种酶Cre，COL10A1 Cre重组和聚蛋白多糖-Cre重组^ERT2（ 此Agg-Cre重组^ERT2）的下颌骨髁发育过程中直接转变成成骨细胞和骨细胞，越过与ROSA26 ^tdTomato。无论Col10和蛋白聚糖被公认的标记物软骨细胞。

在此基础上，我们开发了一种新方法，细胞谱系通过分析细胞特异性标志物的表达在用荧光免疫-以限定细胞的命运一起跟踪。 RUNX2（对于早期骨细胞的标记）和牙本质基质蛋白1（DMP1;对于晚期骨细胞的标记）为用于鉴定软骨衍生骨细胞和它们的分化状态。这种组合不仅拓宽细胞谱系追踪中的应用，而且还简化了化合物的小鼠的产生。更重要的是，亲本细胞的后代的数量，位置和分化状态同时显示，提供比细胞谱系单独跟踪的详细信息。总之，细胞谱系追踪技术和免疫荧光共应用是用于体内研究细胞生物学的有力工具。

引言

在开发过程中，软骨内骨形成占骨架体积的80％以上。人们普遍认为，这首先肥大软骨细胞的凋亡。接着，从底层骨髓细胞侵入并启动血管生成，随后通过骨髓和骨膜衍生细胞^-1,2-新骨沉积。肥大软骨细胞的细胞命运（HCS），然而，一直是人们争论的一个问题，几十年来^3。最初，碳氢化合物被认为是软骨细胞分化途径的端部，和凋亡普遍认为是碳氢化合物的最终命运。现在，一些研究人员认为，至少有一些碳氢化合物能够生存，并有助于软骨内成骨。虽然他们提议生长板软骨不得不转分化成基于超微结构，免疫组织化学染色的成骨细胞的能力，以及在体外研究^46中 ，这些方法瓦特埃雷在证明对成骨细胞谱系的贡献软骨明确。

该细胞谱系追踪技术提供了一种更严格的方式来研究细胞命运。简要地说，一个重组酶，这是只在特定类型的细胞中表达，刺激报道基因的表达。以这种方式，这种类型的细胞及其后代被永久标记^7。该Cre的loxP系统在谱系追踪常用。酶Cre（重组酶酶）将切除两个loxP位点之间的停止序列和激活报告在特定的细胞系（ 图1A）。在一些情况下，研究者可以选择有利的时间点，通过使用一种药物，例如他莫昔芬激活酶Cre，引起酶Cre熔合到雌激素受体（酶Cre ^ERT2）8的改进形式。荧光记者已成为谱系追踪实验，因为他们大幅降低复杂性的标准和提....

研究方案

所有协议进行审查和机构动物护理和使用委员会（IACUC）在得克萨斯A＆牙科M大学学院批准。

1.动物育种

1. 在这项研究中使用三种动物模型。为了研究胚胎软骨细胞的形成髁的命运，第一次使用COL10A1 Cre重组 ¹⁵只和ROSA26 ^tdTomato越过他们（B6; 129S6- 亿吨（ROSA）26Sor ^{TM9（CAG-tdTomato）HZE} / J）小鼠获得Col10a1-综合招聘考试及ROSA26 ^tdTomato老鼠。接下来，跨越这些小鼠2.3Col1a1-GFP小鼠^16。使用COL10A1 Cre重组; ROSA26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP的小鼠进行细胞谱系追踪试验（ 图1B）。
2. 为了研究产后软骨细胞的命运，遵循相同的程序与步骤1.1，但使用蛋白多糖，CRE ^ERT2（ 总比分Cre重组^ERT2）17,18线，并保持此Agg Cre重组^ERT2; ROSA26

结果

软骨细胞直接转变成在颌骨髁状突和长骨骨细胞（成骨细胞和骨细胞）。

聚集蛋白聚糖 ，对软骨的关键基因，主要表现为早期和成熟的软骨细胞^18。其结果是，在2周的年龄在此Agg-Cre重组^ERT2三苯氧胺的注射液; ROSA26 ^tdTomato激活小鼠红番茄记者在所有的软骨细胞和它们?.......

讨论

由于技术限制，它始终是难以调查细胞在体内的行为。然而，细胞谱系追踪技术已被证明是用于研究细胞生物学^7-9的有力工具。在这项研究中，我们进一步通过与免疫相结合的方法进行改进。以这种方式，细胞命运可以由多个相关的标志物，从而拓宽谱系追踪中的应用来定义。此外，免疫荧光和番茄信号的此共定位同时显示的创始人细胞，它们的位置，以及它们的分化状态的后代?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS