Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Özet

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Özet

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Giriş

Mitokondri, özellikle adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksijen ile, hücresel enerji metabolizmasında önemli rolleri üstlenirler. Bu hücre ölümü ve çeşitli insan hastalıklarında implike edilmiştir. Mitokondrial oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) oksijen tüketimi ve ATP sentezi ile elektron taşıma zinciri boyunca elektron taşıma birleştirir. Mitokondriyal trikarboksilik asit (TCA) döngüsü nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ve flavin adenin dinükleotit enerji bakımından zengin bileşimler (FADH ₂₎ içine protein, karbonhidrat ve yağ arasında dönüşüm yer almaktadır. NADH ve FADH ₂ elektronlar solunum elektron taşıma zinciri protein kompleksleri aktarılır (I IV), iç mitokondriyal zarın yer. Buna ek olarak, diğer iki redoks yolları ulaşım zinciri elektron elektron aktarabilirsiniz: i) mitokondriyal elektron-transfer flavoprotein (ETF), iç mito matris yüzünde yer almaktadıryağ asidi β-oksidasyon chondrial membran ve malzemeleri elektronlar; ve ii) dihidroksiaseton fosfat gliserofosfat oksitlenir ve mitokondriyal elektron taşıma zinciri elektronları besleyen mitokondriyal gliserofosfat dehidrojenaz. Kompleks IV (elektron kabul eden) su, iki molekül oksijen dönüştürülmesi, tek bir oksijen molekülüne transfer eder. I'den IV'e kadar solunum elektron taşıma zinciri kompleksi elektron taşıma mitokondriyal iç membran boyunca bir elektrokimyasal gradyanı oluşturur arası boşluğa mitokondriyal matris proton akışı ile birleştirilir. Daha sonra, mitokondriyal kompleks V (ATP sentaz) geri mitokondrial matriks içine hidrojen iyonlarını mekik ve ATP molekülleri sentezler. OXPHOS fonksiyonu elde edilebilir çeşitli teknikler ve çeşitli mitokondriyal solunum durumları kullanılarak in vivo ve in vitro olarak değerlendirilebilir. İzole mitokondri aşağıdaki respirato içindeRy Devletler ölçülebilir: i) taban mitokondriyal solunum (durum 1) mitokondriyal solunum zinciri kompleksi, belirli alt-tabakaların ilave edildikten sonra, ii) oksijen tüketimi (durum 2), III) maksimal mitokondriyal oksijen tüketimi doyurucu konsantrasyonlarının ilave edildikten sonra adenozin difosfat (ADP) (devlet 3) ve ATP dönüştürülür ADP tüketimi (sonra iv) istirahat solunum) (devlet 4). sağlam hücrelerde takiben solunum durumları ölçülebilir: i) taban hücresel oksijen tüketimi endojen substratları ve ADP mevcudiyetinde, ii) oligomycin varlığında bazal hücre oksijen tüketimi (oligomycin hassas olmayan solunum) ve oligomycin duyarlı solunum (ATP kaybı) antimisin ve rotenone ilave edilmesinden sonra, iii) FCCP bağlanmamış solunum, ve iv) olmayan mitokondriyal solunum. permeabilize hücrelerde, elektron taşıma zinciri kompleksleri ve ADP özel substratlar eklendi ve maksimal kompleks bağımlı solunum hızları ler olabiliruch gibi karmaşık I-, II- ve IV-bağımlı solunum oranları ölçülebilir.

Hücresel solunum ölçümleri kompleksleri I-IV, mitokondriyal bütünlüğü ve enerji metabolizması ^{1, 2, 3} özel mitokondriyal solunum kapasitesi önemli bilgiler sağlamaktadır. Yüksek doğruluk, çözünürlük ve hassasiyet ile mitokondriyal oksijen tüketimi ölçümleri sağlayacak cihazlardan biri yüksek çözünürlüklü Oksigraf ^4'tür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf cihaz enjeksiyon portu ile iki bölmeyi içerir ve her bölme bir polarografik oksijen sensörü ile donatılmıştır. Hücresel ya da izole mitokondriyal süspansiyonlar respirometredeki sürekli karıştırılır. mitokondriyal kompleks aktivitesi için mitokondriyal fonksiyon, alt tabakaların ve inhibitörlerin değerlendirmek için standart protokoller izlenerek eklenebilir. Alt tabakaların ve inhibitörlerin enjeksiyon int ile titre edilebilirOksigraf odaları ve oksijen tüketimi oranları o yazılımı kullanılarak hesaplanır ve hücrelerin sayısı başına saniyede pikomol olarak ifade edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Solunum artan hassasiyet ve sağlam veya permeabilize hücrelerin biyolojik numunelerin az sayıda çalışma yeteneği de dahil olmak üzere, geleneksel ve konvansiyonel polarografik oksijen elektrod cihazlar fazla birkaç avantaj sunar. Buna ek olarak, her bir cihaz iki odayı içeriyor ve solunum hızları, oksijen konsantrasyonlarının karşılaştırmalar için eş zamanlı olarak kaydedilebilir. yüksek çözünürlüklü Oksigraf geleneksel polarografik oksijen elektrod cihazlara kıyasla aygıt odalardan oksijen azalma sızıntı avantajı vardır. Son zamanlarda hücresel oksijen tüketimini ölçmek için geliştirilen başka bir aygıt 96-iyi hücre dışı akı analiz ^5'tir. Hücre dışı akı analizörü yerine polarografik sensörler floresan ile donatılmıştır. hücre dışı avantajlarıyüksek çözünürlüklü Oksigraf I olan) bu ii) 24 ve yüksek verimli tarama için 96-yuvalı plakalar içinde oksijen tüketimini ölçmek mümkündür, büyük ölçüde otomatik bir cihaz ile karşılaştırıldığında akış Analiz Cihazı, Bu nedenle, biyolojik numunelerin düşük miktarda gerektiren ve iii) hücresel glikolitik akı ilave ölçüm mümkündür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf kıyasla dışı akı analizörü dezavantajları) cihazın ve olmayan tekrar kullanılabilir floresan plakalar gibi sarf yüksek maliyetler i, ve ii) tahlil başına sadece dört bileşikler / kuyu enjektabl vardır için, sistem Alt tabaka uncoupler inhibitörü titrasyon protokolleri için uygun değildir.

Bu çalışmada, biz mitokondriyal solunum belirlemek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanın. Hücresel oksijen tüketimi deneyler için hücreler complexe elektronları beslenmesi için eksojen ADP ve okside mitokondriyal substratların girişine izin permeabilizeSolunum sistemi s. Bu yaklaşım, (çok yüzeye hücre geçirgenliği olmayan olan) olduğu gibi hücrelere kıyasla belirgin bir avantajı bireysel mitokondriyal kompleksleri solunum kapasitelerinin diseksiyon sağlar. Ancak, hücre zarı permeabilization dışı ortam ile dengelenir sitozol ve hücre dışı alan ve orta (sitozolik çözünenlerin dışarı yıkama) ve hücre içi alan kompozisyonu arasındaki engeli bozacak. sağlam hücreler üzerinde permeabilize hücrelerin dezavantajlarından biri, deterjan aşırı miktarda hücre geçirgenliği esnasında kullanılan halinde mitokondriyal dış membran hasar olabilir. sağlam hücrelerde bazal, sağlam hücreler birleştirildi ve bağlanmamış solunum ölçülebilir. Bu yöntem, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen ve aynı zamanda maksimal mitokondriyal elektron transpo hakkında bilgi veren, eksojen substratları ve ADP ilavesi olmadan sağlam hücrelerin oksijen tüketimini değerlendirirrt kapasitesi ^{6, 7.} permeabilize hücrelerin içinde sağlam hücreler avantajlarından biri, hücre ortamında bozulmaz ve mitokondri hücrelerin bütün bileşenleri ile temas halinde olmasıdır. Hücresel plazma membran geçirgenliği için, bu tür digitonin deterjanlar ⁸ kullanılmıştır. digitonin aşırı miktarda kullanıldığında Ancak, mitokondriyal dış membran bütünlüğünü tehlikeye girebilir. permeabilize hücrelerin bozulmamış olduğunu mitokondriyal dış membran bütünlüğünü doğrulamak için digitonin titrasyon hücre geçirgenliği için optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için hücreler solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve digitonin konsantrasyonu ölçülür mitokondriyal substratları ve ADP ve solunum oranları varlığında Respirometrik titre edilir. sağlam olmayan permeabilize hücrelerin solunum mitocho mevcudiyetinde stimule değildirndrial yüzeyler ve ADP. Bununla birlikte, daha sonra adım adım digitonin titrasyonu plazma zarlarının kademeli geçirgenliği üretebilecektir ve optimal digitonin konsantrasyonu elde edilir. Bu, tam permeabilization solunum up artış gösterilmiştir. Mitokondriyal kalite ve dış membran bütünlüğü eksojen sitokrom c ^{2, 9} eklenerek kontrol edilebilir. Sitokrom c mitokondrial elektron taşıma zinciri ^{10, 11, 12,} 12 kDa elektron taşıyan proteindir. Bu mitokondriyal arası boşluğa lokalize olur, ve kompleks IV karmaşık III elektron taşıyan, oksijen tüketimi yer almaktadır. mitokondrial dış membran zarar görmüşse, sitokrom-c serbest bırakılır ve mitokondriyal oksijen tüketimi azalır. Eksojen sitokrom c eklenmesi üzerine, mitokondriyal solunum herhangi büyütme bir göstergesidirmitokondriyal dış membran bozulur.

Permeabilize hücreler, yüzeyler ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri çeşitli protokolleri ^{3, 9,} aşağıdaki eklendi edilir. mitokondriyal kompleks tahrik solunum oranları araştırmak amacıyla, örneğin, aşağıdaki protokol kullanılabilir. hücre geçirgenleştirmeden sonra birinci kompleks I solunum zinciri için alt-tabaka olarak NADH üretir ve sonra ADP ATP (durum 3, aktif bir dönüşüm için ilave kompleks I'in aktivasyonunu tahrik substratlar malat ve glutamat ile uyarılır kompleks I-bağımlı solunum). Bir sabit sinyal ulaşıldıktan sonra, rotenon (mitokondriyal kompleks I inhibitörü) Rotenone FADH ₂ süksinat ardından kompleks I. inhibe ettiği ve kompleks II (State 3, aktif bir kompleks II bağımlı solunum) aktif hale getirmek için tatbik edilmektedir. Karmaşık IV-bağımlı solunum, ilk kompleks III ölçmek içinbağımlı solunum antimisin (mitokondriyal kompleks III inhibitörü) eklenerek engellendi. Daha sonra kompleks IV bağlı solunum askorbat ve tetramethylphenylendiamine (TMPD) uygulanması ile uyarılır. TMPD dolayısıyla maksimal kompleksi IV bağımlı solunum hızı (Durum 3) önce ve sodyum azid, mitokondriyal kompleks IV inhibitörünün eklenmesinden sonra solunum oranları çıkarılmasıyla hesaplanır, solunum tamponu otomatik oksitleyebilir. solunum deneyleri, bir kontrol (uyarılmamış hücreler) olarak hizmet eden paralel birinde Oksigraf iki odası, diğer ihtiva eden uyarılmış hücrelerde gerçekleştirilebilir. Bunların oksijen tüketimi Oksigraf odası içinde ölçülmeden önce Açıkçası, hücreler, mitokondriyal fonksiyonlarını etkileyen ilaçlarla, örneğin, çeşitli şekillerde, önceden işleme tabi tutulabilir. Bu protokol, bireysel mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri fonksiyonel muayene izin verir. Buna ek olarak, tek bir maksimum ADP-uyarımlı ölçebilirsolunum palmitat şeklinde eksojen yağ asit kullanılarak permeabilize hücrelerin (devlet 3). (: 1 mol oranında palmitat: BSA 6) Bu protokol, sodyum palmitat konsantre edildi stokları derece yağlı asit içermeyen sığır serumu albümini (BSA) ile konjüge edilir. Bundan sonra birinci Digitonin ve mitokondriyal solunum ile permeabilize hücrelerin karnitin eklenmesi ile değerlendirilir ve ADP (durum 3, maksimum solunum) ilave edildi palmitat. Ardından, oligomycin durumu 4 (devlet 4o) ve solunum kontrol oranı (RCR değeri) taklit ilave edilir devlet 3 / devlet 4o olarak hesaplanmıştır. β-oksidasyon elektron transfer flavoprotein ve β-hidroksiaçil-KoA dehidrogenaz tarafından elektron taşıma zinciri geçirilen elektronlar olan FADH ₂ ve NADH, bir (TCA döngüsünde girer) asetil CoA üretimini ve üretimi teşvik. Mitokondri palmitat-BSA protokolü yağ inceleyerek araştırmacılar tarafından kullanılabilir yağlı asit metabolizmasının merkezinde ve tarif edilenty asit oksidasyonu. Sağlam hücreler, aktivatörleri ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri farklı bir protokole ^{6, 9,} aşağıdaki ilave edilir. Bu deneyler için, eksojen alt-tabakaların yokluğunda olmayan permeabilize hücrelerin birinci oksijen tüketimi (solunum oranı fosforile) ile ölçülür. Daha sonra, sigara fosforile solunum hızı mitokondriyal ATP sentazının bir inhibitörü olan oligomycin eklenmesi sonra ölçülür. Daha sonra, protonophore karbonil siyanür p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) çeşitli konsantrasyonlarda yönetilmektedir ve maksimal mitokondriyal uncoupled solunum hızı ölçülür. Böyle FCCP olarak Protonophores kemiosmotik degrade dağıtmak için protonların pasif hareket etmesine izin verir iç zarı proton geçirgenliğinin bir büyütme neden olabilir. Proton geçirgenlik artışı oksidatif solunum (ATP üretimi) birbirinden ayrılacak ve o da bir artışa neden olurxygen tüketimi. Daha sonra, rotenon ve antimisin mitokondriyal solunum inhibe etmek için ilave edilir ve olmayan mitokondriyal solunum diğer solunum hızları çıkarılır.

Oksijen tüketim oranları (kapalı oksijen odasında) hacim özel oksijen akı bölünmesiyle hesaplanır IO ₂ [pmol x saniye ^-1 x 10 ^-6 hücre] (milyon hücre başına oksijen akışı), JV, O şeklinde ifade edilebilir ₂ [pmol X ^sn-1 X mi ^-1] hücre konsantrasyonu hücre odası içinde (hacim başına hücre sayısı [10 ⁶ hücre ∙ mi ^{1]) 15.} Hücre başına kütle bölü hücre-kütle özel oksijen akı, JO ₂ [pmol x saniye ^-1 x mg ^-1], hücre başına akışı, IO ₂ [pmol x saniye ^-1 x 10 ^-6 hücre], [mg ∙ 10 ⁶ hücre]; veya hacim özgü akı, JV, O ₂ [pmol x saniye ^-1 x ml ^-1], vol başına kütle bölüume [mg ∙ mi ^1]. JO ₂ hücre proteininin, kuru ağırlık veya hücre hacmi başına oksijen akıdır.

yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak bu çalışmada, biz, iii) mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri eksojen sitokrom c kullanarak) I tam hücresel plazma zarı geçirgenliği için optimum digitonin konsantrasyonu (digitonin titrasyon deneyi), ii) mitokondrial dış membran bütünlüğü i belirlemek için protokoller tarif eksojen ADP ve mitokondriyal solunum zinciri alt tabakalar ve mevcudiyetinde Digitonin permeabilize HepG2 hücrelerinde II ve IV maksimum solunum oranları IV) bazal, eksojen alt-tabakaların eklenmeden bağlı olan ve sağlam hücreler maksimum bağlanmamış solunumu (maksimum elektron taşıma kapasitesi) ve ADP, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen.

Protokol

1. Hücre Kültürü

1. Kültür, insan hepatomu HepG2 hücreleri ⁶ cm 25 bir inkübatör (% 5 CO, 37 ° C 'de,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren Dulbecco Değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde ² hücre kültürü şişeleri _2,% 95 hava) (ekim yoğunluğu: 1 x 10 ⁶ hücre başına 25 cm ² hücre kültürü şişesi, 37 ° C inkübatör inkübasyon süresi: 48 saat, confluency hücre yoğunluğu: 25 cm başına 4-5 x 10 ⁶ hücre ² hücre kültürü şişesi).
2. Hücreler% 90,% 95 konfluent olduğunda deneyleri.

Polarografik Oksijen Sensörleri 2. Yüksek çözünürlüklü Solunum Kalibrasyon

1. Pipet 2.1 bir Oksigraf odası içine solunum ml tampon sürekli kararlı bir oksijen akışının sinyaline kadar 1 saat süre ile 37 ° C 'de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak tampon karışmayapolarografik oksijen sensörü elde edilir.
   NOT: Her Oksigraf odası ölçü oksijen konsantrasyonu içinde Polarografik oksijen elektrotları ve her odasının içinde oksijen tüketimini (akı) hesaplayın. oksijen konsantrasyonu ve oksijen tüketim oranları (akı) veri toplama ve analiz yazılımı kullanarak bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterilir.
2. Üreticinin protokollerine ^14'e göre polarografik oksijen sensörünün bir hava kalibrasyonunu gerçekleştirin.
   Not: hava doygunluğu deney sıcaklığında ortam solunum ortam ve oksijen konsantrasyonunda polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu yalnızca günde bir kez sabah gerçekleştirilir. Daha sonra ortam odası ve yeni bir solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline hücrelerden çıkarılabilir bir Oksigraf bölmeye ilave edilir ve solunum hızları ölçülür. İlk deneyin ardından, oda yıkanabilir ve deneyler ilave serisi t gerçekleştirilebilirDaha fazla kalibrasyon olmadan aynı bölme.

Yapışık hücreler, Sayma Hücreleri 3. trypsinization

1. Deney gününde, 25 cm ² hücre kültür şişesi DMEM aspire.
2. fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) ile kültür şişelerinde hücre kültürü tek tabaka durulayın.
3. Pipet 0.5 kültür şişelerinde hücre tek içine (37 ° C su banyosu içinde 37 ° C'ye önceden ısıtılmış) Tripsin çözeltisi 25 mg / ml ile yıkanır ve bir inkübatör (% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de 5 dakika inkübe % 95 hava).
4. DMEM hücre kültür şişesi içinde müstakil hücreler içine,% 10 FBS ihtiva eden ve pipetleme hücrelerin süspansiyonu Pipet 5 mi.
5. Aktarım, oda sıcaklığında 350 xg 5 dakika boyunca 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj hücreler yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve süpernatantı süzün.
6. Solunum tamponu ¹³ (t mümkün 1) 1 ml hücre pelletini.
i> hücre sayacı kullanılarak hücre sayımı, 1 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir son yoğunluğa solunum tampon bunları tekrar süspansiyon. hücresel solunum oranları hücre sayısı normalize olacağından, doğru ve kesin hücre sayacı ile hücreleri saymak.

4. Yüksek çözünürlüklü Solunum

1. Hava kalibrasyon (sadece günde bir kez uygulandı, 2.1-2.2 adım) eklendikten sonra, Oksigraf bir bölmeden solunum orta aspire ve odanın adım 3,7 hücre süspansiyonu (1 x 10 ⁶ hücre / ml) 2.1 ml.
2. durdurucunun sokulmasıyla Oksigraf odası kapatın.
3. Sürekli 37 ° C 'de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak hücreler ilave edin ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
   NOT: oksijen konsantrasyonu ve oksijen akı sinyal veri toplama ve analizi için yazılım kullanan bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterildis = "xref"> 14.
4. Daha sonra, aşağıdaki protokollerini kullanarak stoper titanyum enjeksiyon portu üzerinden mitokondriyal solunum için alt tabakaların ve inhibitörlerin enjekte edin.

Respirometrik tarafından sağlam hücrelerde 5. Digitonin Titrasyon

1. Adımları protokol 4.3'e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 ⁶ / ml) hazırlayın.
2. bir şırınga kullanılarak odası stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla hücre süspansiyonu içeren Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) 'DİKKAT' 2 ul enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilene kadar 5-10 dakika hücresel solunum kayıt .
   NOT: Aşağıdaki adımlarda tüm enjeksiyonlar şırıngalar kullanılarak stoper titanyum enjeksiyon portları aracılığıyla yapılmaktadır. rotenone eklenmesi isteğe bağlıdır (ters elektron akışı engeller) ve digitonin titrasyon deneyleri için göz ardı edilebilir, bakınız6.3 adım.
3. Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
4. Oksigraf odası içine 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
5. Oksigraf odasına 2 mM digitonin (2 uM) 2 ul enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen sinyali elde edilene kadar 2-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
6. Yine Digitonin Oksigraf odası içine 2 mm kadar 2 ul enjekte etmek ve sabit bir oksijen sinyali elde edilinceye kadar 2-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
   NOT: hücrelerine digitonin Basamakları eklenmesi hücresel oksijen tüketiminde bir artış ve artacak oksijen akı sinyalini neden olacaktır.
7. odasına 2 mM digitonin kademeli (2-4 uM her adımı) 2-4 ul enjekte devam edin. Her adımdan sonra, 2-5 m hücresel solunum kayıtistikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilinceye kadar içinde.
   NOT: Oksijen akı sinyali maksimum seviyeye ulaşır ve digitonin daha enjeksiyonları solunum oranını artırmak olmadığında digitonin enjekte durdurun. okuyucular adım 6.2 ve deneyler için aşağıdaki protokollerden 7.2 kendi reaktifleri ve kullanım elde edilen optimal digitonin konsantrasyonu kullanılarak kendi laboratuarlarında optimal digitonin konsantrasyonunu belirlemek gerekir.

Mitokondriyal Dış Zar Bütünlüğü 6. Değerlendirme: Sitokrom C

1. Adımları protokol 4.3'e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 ⁶ / ml) hazırlayın.
2. Hücre süspansiyonu (1 x 10 ⁶ / ml) ihtiva eden Oksigraf odası içine 8 mM digitonin (8 uM) 2 ul enjekte edilir ve 5 dakika süreyle hücre geçirgenliği.
3. Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte edilir ve hücresel Respirat kayıtsabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca iyon.
4. Oksigraf odası içine 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
   NOT: hücrelerine ADP eklenmesi karmaşık I teşvik ve oksijen tüketiminde artışa neden ve oksijen akı sinyali artırmak ve stabilize edecek olacaktır.
5. Oksigraf odası içine 4 mM sitokrom c (10 uM) ve 5 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
6. Son olarak, 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) 1 ul enjekte etmek ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar hücresel solunum kaydedin.

7. Maksimal ADP ile uyarılmış Solunum permeabilize HepG2 Hücrelerinin (Eyalet 3)

1. Adımları protokol 4.3'e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 ⁶ / ml) hazırlayın.
2. Hücre süspansiyonu içeren Oksigraf odası içine 8 mM digitonin (8 uM) 2 ul enjekte edilir ve 5 dakika süreyle hücre geçirgenliği.
3. malat 0.8 M (5 mM), 12.5 ul Oksigraf odası içine glutamat 2 M (10 mM), 10 ul enjekte edilir. istikrarlı bir oksijen akı sinyaline kadar rekor hücresel solunum elde edilir.
4. Oksigraf odasına 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
   NOT: hücrelerine ADP eklenmesi oksijen tüketiminde bir artış ve artacak oksijen akı sinyalini neden olacaktır.
5. Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) 'DİKKAT' 2 ul enjekte edilir ve oksijen akı sinyal azalır kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
6. Daha sonra, Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte etmek ve oksijen akışının sinyal artışları kadar hücresel solunum kayıtve sabitler.
7. Ardından, Oksigraf odasına A (5 mcM) 'DİKKAT' antimycin 5 mM 2 ul enjekte ve oksijen akı sinyal azalır kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
8. Daha sonra 0.8 mM askorbat (1 mM) 2.5 ul enjekte etmek ve hemen ardından Oksigraf odası içine 0.2 mM TMPD (0.25 mM) 2.5 ul enjekte oksijen akı sinyali artışları kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder.
9. Son olarak Oksigraf odası içine 1 M sodyum azit (5 mM), "Dikkat" 10 ul enjekte etmek ve oksijen akışının sinyal düşene kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder.

Bozulmamış Hücre 8. Oksijen Tüketimi

1. Adımları protokol 4.3'e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 ⁶ / ml) hazırlayın.
2. Oksigraf odası içeren hücre süspansiyonu içine 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) 1 ul enjekteistikrarlı bir oksijen akı sinyali gelene kadar d rekor hücresel solunum elde edilir.
3. Daha sonra Oksigraf odasına FCCP 0.2 mM (0.1 uM) 'DİKKAT' 1 ul enjekte ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
4. Oksigraf odasına FCCP 0.2 mM (0.4 uM) 3 ul enjekte edilir ve daha fazla oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
5. Oksijen akı sinyali daha sonra maksimal seviyeleri ve hiçbir daha da artar ve ulaşıncaya kadar Oksigraf odasına (odasında 0,1-2 uM son konsantrasyon) 0,2 1 mM FCCP için 1-3 ul enjekte edilerek 0.1 mM 0.3 adımlarla FCCP titre azalan başlar.
   NOT: Oksijen sinyali maksimum seviyeye ulaşır ve azalan başladığında FCCP enjekte durdurun.
6. Daha sonra, 0.2 mM rotenone (0.2 uM) ve hazneye A (5 um) antimycin 5 mM 2 ul 2 ul enjekte edilir. Kayıt solunum t kadaro oksijen akı sinyali azalır ve dengeler.

Sonuçlar

Digitonin Titrasyon Deney: Hücresel permeabilization için Optimum Digitonin Konsantrasyon belirlenmesi

Digitonin titrasyonu HepG2 hücrelerinin nüfuziyet kabiliyeti optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için, digitonin rotenone, süksinat (mitokondriyal kompleks II alt-tabaka) ve ADP bir doyma bir miktarının varlığında sağlam hücrelerde titre edilir, ve solunum başlangıçta ve her ...

Tartışmalar

Mevcut protokolün amacı mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron taşıma sistemi kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ölçmek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanımı idi.

Mevcut protokolde içinde bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, selüler oksijen tüketim oranları genellikle hücrelerin sayısı normalize edilir (pmol / [hücre sn x sayıda]). Bu nedenle, hücre oksijen tüketimi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical