Overvågning Astrocyte reaktivitet og spredning in Vitro iskæmisk-lignende betingelser

Summary

Iskæmisk slagtilfælde er en kompleks event hvor astrocytter til regionen berørte hjerne særlige bidrag udsat for glucose iltmangel (OGD) er vanskelige at undersøge. Denne artikel introducerer en metode til at opnå isolerede astrocytter og studere deres reaktivitet og spredning OGD betingelser.

Abstract

Iskæmisk slagtilfælde er en kompleks hjerneskade forårsaget af en blodprop eller embolus blokerer blodtilførslen til dele af hjernen. Dette fører til fratagelse af ilt og glukose, som forårsager energi fiasko og neuronal død. Efter en iskæmisk slagtilfælde fornærmelse, astrocytter blive reaktive og formere sig omkring skaden site, da det udvikler. Under dette scenario er det svært at studere astrocytter til regionen hjernen udsat for iskæmi særlige bidrag. Derfor, denne artikel introducerer en metode til at studere primære astrocyte reaktivitet og spredning under en in vitro- model af en iskæmi-lignende miljø, kaldet glucose iltmangel (OGD). Astrocytter blev isoleret fra 1-4 dag-gamle neonatal rotter og antallet af ikke-specifik astrocytic celler blev vurderet ved hjælp af astrocyte selektive markør Glial fibrillære sure Protein (GFAP) og nukleare farvning. Perioden hvor underkastes astrocytter OGD betingelse kan tilpasses, samt procentdelen af ilt de udsættes for. Denne fleksibilitet giver forskerne til at karakterisere varigheden af iskæmisk-lignende tilstand i forskellige grupper af celler in vitro. I denne artikel beskrives de tidsrammer af OGD, der inducerer astrocyte reaktivitet, hypertrofisk morfologi og spredning målt ved immunfluorescens ved hjælp af prolifererende celle nukleare Antigen (PCNA). Udover spredning, astrocytter gennemgå energi og oxidativ stress, og reagere på OGD ved at frigive opløselige faktorer i celle medium. Dette medie kan indsamles og bruges til at analysere virkningerne af molekyler udgivet af astrocytter i primære neuronal kulturer uden celle til celle interaktion. I sammendrag, kan denne primære celle kultur model bruges effektivt at forstå rollen af isolerede astrocytter efter skade.

Introduction

Slagtilfælde er defineret som "en akut neurologisk dysfunktion af vaskulær oprindelse med enten pludselig eller hurtig udvikling af symptomer og tegn, svarende til inddragelse af fokale områder i hjernen"^1,2. Der er to typer af slagtilfælde: blødende og iskæmisk. Når vaskulær dysfunktion er forårsaget enten af en aneurisme eller en arteriovenøs funktionsfejl, ledsaget af svækkelse med posterior ruptur af en arterie, er dette kaldes blødende stroke³ som i de fleste tilfælde fører til døden. Når en blodprop eller en embolus hindrer blodgennemstrømningen, kaldes forårsager en midlertidig f....

Protocol

postnatal rotter (Sprague Dawley) 1-4 dage gamle bruges til at isolere cortex. Metoden til aktiv dødshjælp er halshugning, som er godkendt af NIH retningslinjer.

1. forberedelse af instrumenter og materialer til kirurgi

1. Sterilize instrumenter i en autoklave (temperatur: 121 ºC, pres: 15 psi, tid: 30 min) ved hjælp af en stålkasse eller et øjeblik forsegling sterilisation pose. Se materialerne i Table of Materials.

2. Komplet .......

Discussion

Denne protokol beskriver isolering af astrocytter fra rotte cortex. I denne metode er det afgørende at reducere forurening med andre cellulære typer såsom mikroglia, oligodendrocytes, og fibroblaster. For at reducere antallet af mikroglia, kan der tages flere skridt: ændre media, orbital ryster og kemiske behandlinger. Når kultur renhed er bekræftet ved immunfluorescens benytter selektiv cellulære markører eller for de mest fremtrædende celle forureninger, kan eksperimenter udføres. For eksempel, kan antistof m.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus