Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération in Vitro dans des Conditions de type ischémique

Summary

Accident vasculaire cérébral ischémique est un événement complexe dans laquelle l’apport spécifique des astrocytes dans la région du cerveau touchée exposés au manque d’oxygène de glucose (AMG) est difficile à étudier. Cet article présente une méthode pour obtenir des astrocytes isolés et étudier leur réactivité et leur multiplication dans des conditions de ministères.

Abstract

Accident vasculaire cérébral ischémique est un complexe crânien provoqué par un thrombus ou embolie entrave à la circulation sanguine vers les parties du cerveau. Cela conduit à la privation d’oxygène et de glucose, ce qui provoque la défaillance de l’énergie et la mort neuronale. Après une insulte d’accident vasculaire cérébral ischémique, astrocytes devient réactifs et prolifèrent autour du site de la lésion qu’il développe. Selon ce scénario, il est difficile d’étudier la contribution spécifique des astrocytes dans la région de cerveau exposé à l’ischémie. Par conséquent, cet article présente une méthodologie pour étudier la réactivité primaire astrocyte et prolifération dans un modèle in vitro d’un environnement de type ischémie, appelé la privation d’oxygène glucose (AMG). Les astrocytes ont été isolés de 1 à 4 jours-vieux rats néonatals et le nombre de cellules astrocytaires non spécifique a été évaluée à l’aide du marqueur sélectif astrocyte gliale fibrillaire acide protéine (GFAP) et la coloration des noyaux. La période dans laquelle astrocytes sont soumis à la condition de l’AMG peut être personnalisée, ainsi que le pourcentage d’oxygène, qu'ils sont exposés. Cette souplesse permet aux scientifiques de caractériser la durée de la condition de type ischémique dans différents groupes de cellules in vitro. Cet article explique les délais d’AMG qui induisent la réactivité de l’astrocyte, morphologie hypertrophique et prolifération telle que mesurée par l’immunofluorescence utilisant prolifèrent Cell Nuclear Antigen (PCNA). En plus de la prolifération, astrocytes subissent l’énergie et du stress oxydatif et de répondent aux autres ministères en libérant des facteurs solubles dans le milieu cellulaire. Ce moyen de communication peut être collecté et utilisée pour analyser les effets des molécules libérées par les astrocytes dans des cultures primaires de neurones sans interaction cellule-cellule. En résumé, ce modèle de culture cellulaire primaire peut être utilisé efficacement pour comprendre le rôle des astrocytes isolés sur blessure.

Introduction

Accident vasculaire cérébral est défini comme « un dysfonctionnement neurologique aiguë d’origine vasculaire avec développement rapid ou soudain des symptômes et des signes, correspondant à la participation des principaux domaines d’action dans le cerveau »^1,2. Il existe deux types d’AVC : hémorragique et ischémique. Lorsque la dysfonction vasculaire est causée par un anévrisme ou une défectuosité artério-veineuse, accompagné d’affaiblissement postérieur de rupture d’une artère, il s’agit alors d’accident vasculaire cérébral hémorragique³ qui, dans la plupart des cas, conduit à la mort.....

Protocol

postnatals rats (rats Sprague Dawley) 1-4 jours vieux sont utilisés pour isoler le cortex. La méthode d’euthanasie est décapitation, tel qu’approuvé par le NIH guidelines.

1. préparation des Instruments et matériaux pour chirurgie

1. instruments de stériliser à l’autoclave (température : 121 ° c, pression : 15 psi, temps : 30 minutes) à l’aide d’une boîte en acier ou un instant sachet de stérilisation d’étanchéité. Voir des matières Table des

Discussion

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes des cortex de rat. Dans cette méthode, il est essentiel pour diminuer la contamination avec d’autres types cellulaires comme les microglies, oligodendrocytes et fibroblastes. Pour réduire le nombre de cellules microgliales, plusieurs mesures peuvent être prises : changer les médias, orbitale secouant et traitements chimiques. Une fois que la pureté de la culture est confirmée par immunofluorescence à l’aide de marqueurs cellulaires sélectifs ou pour les princ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus