Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Summary

Ischämischen Schlaganfall ist schwer zu lernen ist ein komplexer Vorgang, in dem der spezifische Beitrag der Astrozyten, die betroffene Hirnregion Glukose Sauerstoffmangel (OGD) ausgesetzt. Dieser Artikel stellt eine Methode zur isolierte Astrozyten zu erhalten und ihre Reaktivität und Verbreitung unter OGD Bedingungen zu studieren.

Abstract

Ischämischen Schlaganfall ist eine komplexe-Hirn-Trauma durch einen Thrombus oder Lungenembolie behindern Blutfluss in Teilen des Gehirns verursacht. Dies führt zur Entziehung von Sauerstoff und Glukose, die Energie Versagen und neuronalen Tod verursacht. Nach eine Beleidigung des ischämischen Schlaganfalls Astrozyten werden reaktive und vermehren sich um die Verletzung Aufstellungsort, wie es sich entwickelt. In diesem Szenario ist es schwierig, den spezifischen Beitrag der Astrozyten, die Region des Gehirns ausgesetzt Ischämie zu studieren. Dieser Artikel stellt daher eine Methode zur primären Astrozyten Reaktivität und Verbreitung unter einem in Vitro Modell einer Ischämie-ähnlichen Umgebung, genannt Glukose Sauerstoffmangel (OGD) zu studieren. Astrozyten wurden isoliert von 1-4 Tage-alten Neugeborenen Ratten und die Anzahl der unspezifischen astrocytic Zellen wurde anhand Astrozyten selektive Marker Glial Fibrillary sauren Protein (GFAP) und nukleare Färbung. Der Zeitraum, in dem Astrozyten OGD Zustand ausgesetzt sind, sowie der Sauerstoffgehalt anpassbar, denen sie ausgesetzt sind. Diese Flexibilität ermöglicht es Wissenschaftlern, die Dauer der ischämischen-ähnlichen Zustand in verschiedene Gruppen von Zellen in Vitrozu charakterisieren. Dieser Artikel beschreibt die Zeitrahmen von OGD, die Astrozyten Reaktivität, hypertrophe Morphologie und Verbreitung gemessen durch Immunfluoreszenz mit wuchernden Cell Nuclear Antigen (PCNA) induzieren. Neben der Verbreitung Astrozyten Energie- und oxidativen Stress zu unterziehen, und reagieren auf OGD durch Loslassen lösliche Faktoren in der Zelle-Medium. Dieses Medium kann gesammelt und verwendet, um die Auswirkungen von Molekülen veröffentlicht von Astrozyten im neuronalen Primärkulturen ohne Zell-Zell-Interaktion zu analysieren. Zusammenfassend lässt sich sagen diese Primärzelle Kulturmodells effizient einsetzbar zu verstehen, die Rolle der isolierten Astrozyten auf Verletzungen.

Introduction

Schlaganfall ist definiert als "eine akute neurologische Dysfunktion vaskulären Ursprungs mit plötzlichen oder schnelle Entwicklung der Symptome und Zeichen, entsprechend der Beteiligung der Schwerpunkte im Gehirn"^1,2. Es gibt zwei Arten von Schlaganfällen: ischämische und hämorrhagische. Wenn vaskuläre Dysfunktion verursacht wird, entweder durch ein Aneurysma oder eine arteriovenöse Fehlfunktion, begleitet durch eine Schwächung mit hinteren Ruptur einer Arterie ist dies hämorrhagischer Schlaganfall³ bezeichnet, die in den meisten Fällen zum Tod führt. Wenn ein Thrombus oder eine Lungen....

Protocol

postnatale Ratten (Sprague-Dawley) 1-4 Tage alt werden verwendet, um die Rinde zu isolieren. Die Methode der Euthanasie ist Enthauptung, wie von NIH Richtlinien genehmigt.

1. Vorbereitung der Instrumente und Materialien für Chirurgie

1. Instrumente der Sterilisation in einem Autoklaven (Temperatur: 121 ° c, Druck: 15 Psi, Zeit: 30 Minuten) mit einem Stahlkasten oder Abdichtung Sterilisation Beutel sofort. Materialien in der Tabelle der Materialien zu sehen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Isolation der Astrozyten aus Ratte Cortex. Bei dieser Methode ist es entscheidend, Kontamination mit anderen zellulären Arten wie Mikroglia, Oligodendrozyten und Fibroblasten zu verringern. Um die Anzahl der Mikroglia zu reduzieren, können mehrere Schritte unternommen werden: Ändern der Medien, Orbital, rütteln und chemischen Behandlungen. Wenn Kultur Reinheit durch Immunfluoreszenz mittels selektiver zellulären Marker oder für die prominentesten Zelle Verunreinigungen bestätigt ist.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus