कोरोनरी की तरह शर्तों के तहत इन विट्रो में Astrocyte जेट और प्रसार की निगरानी

Summary

कोरोनरी स्ट्रोक एक जटिल घटना है जिसमें ऑक्सीजन ग्लूकोज़ अभाव (OGD) के संपर्क में आने वाले प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्र में astrocytes का विशिष्ट योगदान अध्ययन करने के लिए मुश्किल है । यह लेख अलग astrocytes प्राप्त करने के लिए एक पद्धति का परिचय और OGD शर्तों के तहत उनके जेट और प्रसार का अध्ययन ।

Abstract

कोरोनरी स्ट्रोक एक जटिल मस्तिष्क चोट मस्तिष्क के कुछ हिस्सों के लिए एक थक्का या थक्का बाधा रक्त प्रवाह की वजह से है । इससे ऑक्सीजन और ग्लूकोज का अभाव होता है, जो ऊर्जा की विफलता और न्यूरॉन की मौत का कारण बनता है । एक कोरोनरी स्ट्रोक अपमान के बाद, astrocytes प्रतिक्रियाशील हो जाते हैं और चोट साइट के आसपास पैदा के रूप में यह विकसित करता है । इस परिदृश्य के तहत, यह मुश्किल है के लिए astrocytes के विशिष्ट योगदान का अध्ययन करने के लिए दिमाग के ischemia को उजागर क्षेत्र । इसलिए, इस अनुच्छेद के एक पद्धति का परिचय एक इन विट्रो मॉडल के तहत प्राथमिक astrocyte जेट और प्रसार का अध्ययन करने के लिए पर्यावरण की तरह, ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव (OGD) कहा जाता है । Astrocytes 1-4 दिन पुराने नवजात चूहों से अलग थे और गैर विशिष्ट astrocytic कोशिकाओं की संख्या astrocyte चयनात्मक मार्कर Glial Fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और परमाणु धुंधला का उपयोग का आकलन किया गया था । अवधि जिसमें astrocytes OGD हालत के अधीन है अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही साथ ऑक्सीजन का प्रतिशत वे करने के लिए उजागर कर रहे हैं । यह लचीलापन वैज्ञानिकों को इन विट्रो मेंकोशिकाओं के विभिन्न समूहों में कोरोनरी की तरह हालत की अवधि को चिह्नित करने की अनुमति देता है । यह आलेख चर्चा करता है कि OGD की समय सीमा astrocyte जेट, hypertrophic आकृति विज्ञान और प्रसार के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मापा Proliferating सेल परमाणु Antigen (PCNA) का उपयोग कर । प्रसार के अलावा, astrocytes ऊर्जा और oxidative तनाव से गुजरना, और कोशिका माध्यम में घुलनशील कारकों को रिहा करके OGD का जवाब । इस माध्यम एकत्र किया जा सकता है और कोशिका के लिए सेल संपर्क के बिना प्राथमिक ंयूरॉंस संस्कृतियों में astrocytes द्वारा जारी अणुओं के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया । संक्षेप में, इस प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल कुशलता से चोट पर अलग astrocytes की भूमिका को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

स्ट्रोक "संवहनी मूल के एक तीव्र स्नायविक रोग के रूप में या तो अचानक या लक्षण और संकेत के तेजी से विकास के साथ परिभाषित किया गया है, मस्तिष्क में फोकल क्षेत्रों की भागीदारी के लिए इसी"^1,2. वहाँ स्ट्रोक के दो प्रकार के होते हैं: रक्तस्रावी और कोरोनरी. जब नाड़ी रोग या तो एक धमनीविस्फार या एक paco खराबी, एक धमनी के पीछे टूटना के साथ कमजोर के साथ के कारण होता है, इस रक्तस्रावी स्ट्रोक³ जो, ज्यादातर मामलों में, मौत की ओर जाता है । जब एक थक्का या एक थक्का पहुंचा रक्त प्रवाह, ऑक्सीजन और एक मस्तिष्क क्षेत्र में ग्लूकोज की एक अस्थाई अभाव के कारण, यह कोरोनरी स्ट्रोक⁴कहा जात....

Protocol

< p class = "jove_content" > प्रसव चूहों (Sprague Dawley) 1-4 दिन पुराने cortices को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है । इच्छामृत्यु की विधि decapitation है, जैसा कि NIH दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित है ।

< p class = "jove_title" > 1. सर्जरी के लिए उपकरणों और सामग्री की तै?.......

Discussion

यह प्रोटोकॉल चूहे cortices से astrocytes के अलगाव का वर्णन करता है । इस विधि में, यह microglia, oligodendrocytes, और fibroblasts जैसे अंय सेलुलर प्रकार के साथ संदूषण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । microglia की संख्या को कम करने के लिए, कई कदम उठाए ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus