사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

요약

허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.

초록

허 혈 성 뇌졸중은 혈전 또는 두뇌의 부분에 혈액 흐름을 방해 하는 embolus로 인 한 복잡 한 뇌 손상. 이것은 산소와 포도 당, 에너지 실패 원인과 신경 죽음의 부족. 허 혈 성 뇌졸중 모욕 후 이다 반응 되 고 그것은 개발로 부상 사이트 격 증. 이 시나리오에서는 허 혈에 노출 된 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여를 공부 하기 어렵습니다. 따라서,이 문서의 기본 사이토 반응성 산소 포도 당 부족 (지도부) 라는 허 혈 같은 환경의 체 외에 모델 확산을 공부 하는 방법을 소개 합니다. 이다 1-4 일에서 고립 되었다-오래 된 신생아 쥐와 일반적인 astrocytic 셀 수 사이토 선택 마커 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 및 핵 얼룩을 사용 하 여 평가 했다. 기간 이다 지도부 조건에 복종 된다 수 사용자 지정할 수, 그들은에 노출 되는 산소의 백분율 뿐만 아니라. 이 유연성 과학자를 셀 체 외의 다른 그룹에서 허 혈 성 같은 상태 기간 특성을 수 있습니다. 이 문서에서는 사이토 반응성, hypertrophic 형태학 및 확산 증식 세포 핵 항 원 (PCNA)를 사용 하 여 면역 형광 검사로 측정 된 유도 지도부의 시간대를 설명 합니다. 확산, 게다가 이다 에너지와 산화 스트레스를 받게 하 고 응답 지도부 셀 중간에 녹는 요소를 해제 하 여. 이 매체는 수집 고 분자 이다 세포 세포 상호 작용 없이 기본 신경 문화에 의해 발표의 효과 분석 하는 데 사용 될 수 있습니다. 요약 하자면,이 1 차 셀 문화 모델 부상 시 절연된 이다의 역할을 이해 하 효율적으로 사용할 수 있습니다.

서문

선 "는 급성 신경 부전 혈관 근원의 증상 및 징후, 뇌의 초점 분야의 참여 하에 해당의 급격 하거나 급속 한 개발"^1,2로 정의 됩니다. 뇌졸중의 두 가지 유형이 있다: 출혈 및 허 혈 성. 혈관 장애는 동맥 류 또는 arteriovenous 오작동, 약화의 동맥, 후부 파열과 동반 하 여 발생 하는 경우이, 죽음에 이르게 하는 대부분의 경우에는 출혈 성 뇌졸중³ 이라고 불린다. 혈전 또는 embolus 혈액 흐름을 방해, 산소와 포도 당 두뇌 지역에의 임시 박탈을 일으키는 그것 이라고 뇌경색⁴합니다. 영향을 받는 지역 또는 항상성 및 대사 불균형, 에너지 장애, 신경 죽음, 및 염증⁵, 환자⁶평생 장애를 일으킬 수 있는 허 혈 성 핵심 리드 주위 세포를 키 우다 실패.

허 혈 성 뇌졸중은 반응 하 고 다른 시간 지점에서 그들의 효과 발휘 하는 셀의 여러 종류를 포함 multifactorial 부상이 다. 많은 상호 작용 개별 셀의 동작을 연구 하는 어려운 환경을 만들....

프로토콜

1-4 일 산 후 쥐 (Sprague Dawley) 오래 된 외피가 분리 하는 데 사용 됩니다. 안락사는 잘린, NIH 지침에 의해 승인.

1. 악기의 준비와 수술에 대 한 자료

1. 압력솥에 Sterilize 계기 (온도: 121 ° C, 압력: 15 psi, 시간: 30 분) 강철 상자 또는 살 균 주머니 씰링 인스턴트를 사용 하 여. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.

2. DMEM 준비 완료

1. 압력가 물 700 mL를 포함 하는 1 리터 비 커에 추가 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 실 온에서 중간 파우더.
2. 3.7 g/L 나트륨 중 탄산염, 솔루션은 자력으로 자극 하는 동안 추가.
3. 조정 7.4, 압력가 마로 소독 물에 pH 1 L, 볼륨을가지고 필터링 합니다. 10 %FBS 1% 미디어의 원하는 볼륨 보충 목적을 위해 문화, 페니실린/스, 및 37 ˚C에서 따뜻한. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.
   참고: PH 7.4 미디어 pH 미터 전극 삽입을 통해 조정 했다. 천....

결과

기본 astrocytic 문화의 주요 관심사 중 하나는 뉴런, oligodendrocytes, 섬유 아 세포, microglia 등 다른 세포의 존재 이다. 그림 1에서 쥐 외피가에서 고립 된 셀 미디어 변경 3 일 마다 졌고 중 치료 또는 치료와 함께 추가 LME 1 h. 24 시간 후에, 세포에 GFAP immunostained 되었고 DAPI와 counterstained. LME 치료 셀 8% 보여주었다 동안 치료 셀 긍정적인 세포 GFAP-39% 비의 평균.......

토론

이 프로토콜 이다 쥐 외피가에서 격리를 설명합니다. 이 방법에서는, 그것은 microglia, oligodendrocytes, 섬유 아 세포 등 다른 세포 종류와 오염 감소에 중요 한입니다. Microglia의 수를 줄이기 위해, 몇 가지 단계를 취할 수 있습니다: 미디어, 떨고, 궤도 및 화학 치료를 변경. 가장 눈에 띄는 셀 오염 물질에 대 한 선택적 세포 마커를 사용 하 여 면역 형광 또는 문화 순수성을 확인 실험을 수행할 수 있습?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus