Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas

Summary

Accidente cerebrovascular isquémico es un evento complejo en el que la contribución específica de los astrocitos de la región del cerebro afectada expuesta a privación de glucosa oxígeno (OGD) es difícil de estudiar. Este artículo presenta una metodología para obtener aislados astrocitos y estudiar su reactividad y la proliferación en condiciones OGD.

Abstract

Accidente cerebrovascular isquémico es una lesión compleja del cerebro causada por un trombo o émbolo obstruye el flujo sanguíneo a partes del cerebro. Esto conduce a la privación de oxígeno y glucosa, lo cual provoca falta de energía y la muerte neuronal. Después de un insulto isquémico movimiento, astrocitos se reactiva y proliferan alrededor del sitio de la lesión que desarrolla. Bajo este escenario, es difícil estudiar la contribución específica de los astrocitos de la región del cerebro expuesto a isquemia. Por lo tanto, este artículo presenta una metodología para estudiar la reactividad de astrositos primaria y proliferación bajo un modelo en vitro de un entorno similar a isquemia, llamado privación de glucosa oxígeno (OGD). Los astrocitos fueron aislados de 1-4 días-viejas ratas neonatales y el número de células astrocytic no específica se evaluó mediante marcador selectivo de astrositos proteína ácida fibrilosa Glial (GFAP) y tinción nuclear. El período en el que los astrocitos son sometidos a la condición de la OGD se puede personalizar, así como el porcentaje de oxígeno que están expuestos. Esta flexibilidad permite a los científicos caracterizar la duración de la enfermedad isquémica como en los diferentes grupos de células in vitro. Este artículo aborda los plazos del OGD que inducen proliferación medido por inmunofluorescencia utilizando la proliferación de la célula Nuclear antígeno (PCNA), reactividad astrositos y morfología hipertrófica. Además de la proliferación, astrocitos experimentan la energía y el estrés oxidativo y responden a inclinacion por liberación de factores solubles en el medio celular. Este medio puede ser recogido y utilizado para analizar los efectos de moléculas liberadas por astrocitos en cultivos neuronales primarios sin interacción de célula a célula. En Resumen, este modelo de cultura de célula primaria puede utilizarse eficientemente para entender el papel de los astrocitos aislados tras lesiones.

Introduction

Movimiento se define como «una aguda disfunción neurológica de origen vascular con desarrollo rápido o repentino de los síntomas y signos, correspondiente a la participación de las áreas del cerebro»^1,2. Hay dos tipos de ictus: isquémico y hemorrágico. Cuando la disfunción vascular es causada por un aneurisma o un mal funcionamiento arteriovenoso, acompañado de debilitamiento con la posterior ruptura de una arteria, esto se denomina accidente cerebrovascular hemorrágico³ que, en la mayoría de los casos, conduce a la muerte. Cuando un trombo o un émbolo obstruye flujo de la sangre, causa....

Protocol

postnatales ratas (Sprague Dawley) 1-4 días viejos se utilizan para aislar las cortezas. El método de eutanasia es decapitación, aprobado por las directrices NIH.

1. preparación de instrumentos y materiales para la cirugía

1. esterilizar instrumentos en autoclave (temperatura: 121 º c, presión: 15 psi, tiempo: 30 minutos) con una caja de acero o un instante sellado bolsa de esterilización. Ver en Tabla de materiales materiales.

Discussion

Este protocolo describe el aislamiento de los astrocitos de las cortezas de la rata. En este método, es fundamental para disminuir la contaminación con otros tipos celulares como los fibroblastos, microglia y oligodendrocitos. Para reducir el número de microglía, se pueden tomar varias medidas: cambio de medios de comunicación, agitación orbital y tratamientos químicos. Una vez pureza cultura confirmado por inmunofluorescencia utilizando marcadores selectivos de celulares o para los más importantes contaminantes .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus