Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Summary

İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.

Abstract

İskemik inme trombüsü veya kan akımı beyin bölümlerine tıkayan embolinin kaynaklanan bir karmaşık beyin hasarı var. Bu oksijen ve enerji yetmezliği ve nöronal ölüm nedenleri glikoz yoksunluğu için yol açar. İskemik inme hakaret sonra astrocytes reaktif olmak ve bu geliştikçe yaralanma sitenin etrafına çoğalırlar. Bu senaryoda, astrocytes iskemi için maruz beyin bölgesi için belirli katkısını çalışma zordur. Bu nedenle, bu makalede birincil astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı oksijen glikoz yetmezliği (OGD) adı verilen bir iskemi gibi ortamının bir vitro modeli altında çalışmaya bir metodoloji tanıtılmaktadır. Astrocytes 1-4 gün izole-eski yenidoğan fareler ve non-spesifik astrositik hücre sayısı değerlendirildi astrocyte seçici marker gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP'nin) ve nükleer boyama kullanarak. Onlar maruz kalan oksijen yüzdesi yanı sıra astrocytes OGD koşuluna tabi olan dönem özelleştirilebilir. Hücre içinde vitrofarklı grupları iskemik benzeri durumda süresince ayırdetmek bilim adamları bu esneklik sağlar. Bu makalede astrocyte reaktivite, Hipertrofik morfoloji ve Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA) kullanarak ayirt tarafından ölçülen yaygın neden zaman dilimleri OGD, anlatılmaktadır. Hızla çoğalmak, yanı sıra astrocytes enerji ve oksidatif stres geçmesi ve çözünür faktörler cep orta serbest bırakarak OGD için yanıt. Bu orta toplanan ve moleküller hücre hücre etkileşimi olmadan birincil nöronal kültürde astrocytes tarafından yayımlanan etkilerini çözümlemek için kullanılır. Özet olarak, bu birincil hücre kültür model verimli bir şekilde yaralanması üzerine izole astrocytes rolünü anlamak için kullanılabilir.

Introduction

Kontur "bir akut nörolojik disfonksiyon vasküler kökenli ani veya hızlı geliştirme belirti ve bulguları, karşılık gelen beyin Fokal alanlarda katılımı ile"^1,2olarak tanımlanır. Kontur iki tür vardır: Hemorajik ve iskemik. Vasküler disfonksiyon ya beyin kanaması veya posterior bir arter rüptürü ile zayıflaması tarafından eşlik arteriyovenöz bir arıza neden olduğu bu, çoğu durumda, ölüme götürecek hemorajik inme³ olarak adlandırılır. Bir trombüsü veya bir pıhtısı kan akışını engelleyen, oksijen ve glikoz bir beyin bölgesine geçici bir yoksunluk neden iskemik inme⁴d....

Protocol

doğum sonrası fareler (Sprague Dawley) 1-4 gün eski cortices izole etmek için kullanılır. Ötenazi işten çıkarma, NIH kurallar tarafından onaylanmış yöntemidir.

1. cerrahi için malzeme ve aletler hazırlık

1. bir otoklav içinde Sterilize cihazları (sıcaklık: 121 ºC, basınç: 15 psi, Saat: 30 dakika) metal bir kutu ya da bir anlık sterilizasyon çanta mühürleme kullanarak. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.

Discussion

Bu iletişim kuralı astrocytes sıçan cortices üzerinden yalıtım açıklar. Bu yöntemde, microglia, oligodendrocytes ve fibroblastlar gibi hücresel diğer türleri ile kirlenme azaltmak için önemlidir. Microglia sayısını azaltmak için çeşitli adımlar alınabilir: medya, orbital sallayarak ve kimyasal tedaviler değiştirme. Kültür saflık ayirt seçici hücresel işaretçileri kullanarak veya en önemli hücre kirleticiler için onaylandıktan sonra deneyler yapılabilir. Örneğin, iyonize kalsiyum ba?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus