Toezicht Astrocyt reactiviteit en proliferatie in Vitro ischemische-achtige omstandigheden

Summary

Ischemische beroerte is een complexe gebeurtenis waarin de specifieke bijdrage van astrocyten naar de hersenen van de getroffen regio blootgesteld aan zuurstof glucose ontbering (OGD) moeilijk te bestuderen. Dit artikel introduceert een methodologie voor het verkrijgen van geïsoleerde astrocyten en studeren hun reactiviteit en de proliferatie onder voorwaarden van OGD.

Abstract

Ischemische beroerte is een complexe hersenletsel veroorzaakt door een trombus of embolus obstructie van de bloedstroom naar delen van de hersenen. Dit leidt tot verval van zuurstof en glucose, waardoor energie falen en neuronale dood. Na een ischemische beroerte belediging, astrocyten worden reactieve en vermenigvuldigen rond de site schade als het zich ontwikkelt. In dit scenario is het moeilijk om te bestuderen van de specifieke bijdrage van astrocyten naar de regio van de hersenen blootgesteld aan ischemie. Dit artikel introduceert daarom een methodologie om te bestuderen van primaire Astrocyt reactiviteit en proliferatie onder een in vitro model van een ischemie-achtige omgeving, zuurstof glucose ontbering (OGD) genoemd. Astrocyten werden geïsoleerd vanaf dag 1-4-oude neonatale ratten en het aantal niet-specifieke astrocytic cellen werd beoordeeld met behulp van Astrocyt selectieve marker gliale Fibrillary zuur eiwit (GFAP) en nucleaire kleuring. De periode waarin astrocyten zijn onderworpen aan de voorwaarde van OGD kan worden aangepast, evenals het percentage zuurstof, die ze worden blootgesteld aan. Deze flexibiliteit kan wetenschappers te karakteriseren van de duur van de conditie van de ischemische-achtige in verschillende groepen van cellen in vitro. Dit artikel bespreekt de termijnen van OGD die induceren Astrocyt reactiviteit, hypertrofische morfologie en proliferatie zoals gemeten door immunofluorescentie prolifererende Cell Nuclear Antigen (PCNA) gebruiken. Naast de proliferatie, astrocyten ondergaan energie en oxidatieve stress en te reageren op OGD door het vrijgeven van oplosbare factoren in het medium van de cel. Dit medium kan worden verzameld en gebruikt voor het analyseren van de gevolgen van moleculen uitgebracht door astrocyten bij primaire neuronale culturen zonder tussenkomst van de cel-naar-cel. Kortom, kan dit primaire cel cultuur model efficiënt worden gebruikt om te begrijpen van de rol van geïsoleerde astrocyten bij schade.

Introduction

Beroerte wordt gedefinieerd als "een acute neurologische dysfunctie van vasculaire oorsprong met plotselinge of snelle ontwikkeling van symptomen en tekenen, overeenkomt met de betrokkenheid van de speerpunten in de hersenen"^1,2. Er zijn twee types van een beroerte: hemorragische en ischemische. Wanneer vasculaire dysfunctie wordt veroorzaakt door een aneurysma of een Arterioveneuze storing, vergezeld van verzwakking met posterieure breuk van een slagader, heet dit hemorragische beroerte³ die in de meeste gevallen tot de dood leidt. Wanneer een trombose of een embolus belemmert de bloed....

Protocol

postnatale ratten (Sprague-Dawley) 1-4 dagen oud worden gebruikt voor het isoleren van de cortices. De methode van de euthanasie is onthoofding, zoals goedgekeurd door de NIH richtsnoeren.

1. voorbereiding van de instrumenten en materialen voor chirurgie

1. Sterilize instrumenten in een autoclaaf (temperatuur: 121 ºC, druk: 15 psi, tijd: 30 mins) met behulp van een stalen doos of een instant afdichten sterilisatie etui. Zie materialen in Tabel of Materials.

Discussion

Dit protocol beschrijft het isolement van astrocyten van rat cortices. In deze methode is het cruciaal belang voor het verminderen van de verontreiniging met andere cellulaire soorten zoals oligodendrocyten, microglia en fibroblasten. Verklein het aantal microglia en verschillende stappen kunnen worden genomen: de media, orbital schudden en chemische behandelingen wijzigen. Zodra de zuiverheid van de cultuur wordt bevestigd door immunofluorescentie met behulp van selectieve cellulaire markeringen of voor de meest promine.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus