Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas

Summary

Acidente vascular cerebral isquêmico é um evento complexo, no qual a contribuição específica dos astrócitos à região afetada do cérebro exposto a privação de oxigênio glicose (OGH) é difícil de estudar. Este artigo apresenta uma metodologia para obter isolados astrócitos e estudar sua reatividade e proliferação em condições OGH.

Abstract

Acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão complexa do cérebro causada por um trombo ou êmbolo obstruindo o fluxo sanguíneo para partes do cérebro. Isto leva à privação de oxigênio e glicose, o que faz com que a falha de energia e morte neuronal. Depois de um insulto isquêmico, astrócitos tornar-se reativa e proliferam em torno do local da lesão, como ela se desenvolve. Sob esse cenário, é difícil estudar a contribuição específica dos astrócitos, a região do cérebro exposto à isquemia. Portanto, este artigo apresenta uma metodologia para estudar a reatividade astrocyte primária e proliferação sob um modelo in vitro de um ambiente, como isquemia, chamado de privação de oxigênio glicose (OGH). Astrócitos foram isolados a partir de dia 1-4-velhos ratos Neonatais e o número de células hamartomas específico foi avaliada utilizando marcador seletivo de astrocyte gliais de proteína ácida fibrilar (GFAP) e coloração nuclear. O período em que astrócitos estão sujeitos à condição de OGH pode ser personalizado, bem como a percentagem de oxigênio que estão expostos. Essa flexibilidade permite aos cientistas caracterizar a duração do estado isquêmico, como em diferentes grupos de células in vitro. Este artigo discute os prazos de OGH que induzem a reatividade astrocyte, morfologia hipertrófica e proliferação, como medido por imunofluorescência usando Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Além de proliferação, astrócitos passam por energia e estresse oxidativo e respondem a OGH pela liberação de fatores solúveis no meio de célula. Este meio pode ser coletado e utilizado para analisar os efeitos das moléculas lançados por astrócitos em culturas neuronal preliminares sem interação célula a célula. Em resumo, este modelo de cultura celular primária pode ser usado com eficiência para entender o papel dos astrócitos isolados após lesão.

Introduction

Traço é definido como "uma aguda disfunção neurológica de origem vascular com súbito ou rápido desenvolvimento de sintomas e sinais, correspondentes à participação de áreas focais no cérebro"^1,2. Existem dois tipos de AVC: isquêmico e hemorrágico. Quando a disfunção vascular é causada por um aneurisma ou uma avaria arteriovenosa, acompanhado pelo enfraquecimento com posterior ruptura de uma artéria, este é denominado acidente vascular cerebral hemorrágico³ que, na maioria dos casos, leva à morte. Quando um trombo ou um êmbolo obstrui o fluxo sanguíneo, causando uma temporária privação d....

Protocol

pós-natal ratos (Sprague Dawley) 1-4 dias de idade são usados para isolar os córtices. O método de eutanásia é decapitação, conforme aprovado pelas diretrizes do NIH.

1. preparação de instrumentos e materiais para cirurgia

1. instrumentos esterilize em autoclave (temperatura: 121 ° c, pressão: 15 libras por polegada quadrada, tempo: 30 minutos) usando uma caixa de aço ou uma mágica instantânea selagem bolsa de esterilização. Ver os materiais na Tabela de mater.......

Discussion

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos de córtices de rato. Neste método, é fundamental para diminuir a contaminação com outros tipos celulares como fibroblasto, oligodendrócitos e micróglia. Para reduzir o número de micróglia, várias medidas podem ser tomadas: mudando a mídia, orbital tremendo e tratamentos químicos. Uma vez que a pureza da cultura é confirmada por imunofluorescência usando marcadores celulares seletivas ou para os contaminantes mais proeminentes de célula, experiências pode.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus