A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
Ишемического инсульта является трудным для изучения сложных событий, в котором конкретный вклад астроциты в регионе пострадавших мозга воздействию кислорода глюкозы (OGD). Эта статья знакомит методологию для получения изолированных астроциты и изучить их реактивность и распространения OGD условиях.
Ишемический инсульт является сложный мозга травмы, вызванные тромба или эмболии, препятствующих приток крови к части мозга. Это приводит к лишению кислорода и глюкозы, который вызывает энергии неудачи и нейрональных смерти. После ишемического инсульта инсульт астроциты стать реактивной и распространяться вокруг места повреждения, как она развивается. Согласно этому сценарию трудно изучить конкретный вклад астроциты подвержена ишемии мозга регионе. Таким образом эта статья знакомит методологии для изучения первичного экзоцитоз реактивности и распространения в рамках модели в vitro ишемии как окружающей среды, называется глюкоза лишение кислорода (OGD). Астроциты были изолированы от 1-4 дня-старый новорожденных крыс и количество неспецифические Астроцитарная клеток была оценена с помощью экзоцитоз селективного маркер глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и ядерных окрашивания. Можно настроить период, в котором астроциты подвергаются OGD состояния, а также процент кислорода, которым они подвергаются. Эта гибкость позволяет ученым охарактеризовать продолжительность ишемического как условие в различных группах клеток в пробирке. Эта статья обсуждает таймфреймы OGD, побудить экзоцитоз реактивности, гипертрофический морфологии и распространения как измеряется иммунофлюоресценции с помощью расползанию ядерного антигена клеток (PCNA). Помимо распространения астроциты пройти энергии и окислительного стресса и реагировать OGD, выпустив растворимых факторов в среду клетки. Это средство можно собирается и используется для анализа влияния, выпущенный астроциты в первичной нейрональных культур без ячеек для взаимодействия молекул. В целом эта модель культуры главной ячейки может использоваться эффективно понять роль изолированных астроциты после травмы.
Инсульта определяется как «острый неврологической дисфункции сосудистого происхождения с внезапным или быстрое развитие симптомов и признаков, соответствующего участия областей в мозге»1,2. Существует два типа инсульта: геморрагический и ишемический. При сосудистой дисфункции является причиной аневризмы или артериовенозных неисправности, сопровождается ослаблением с задней разрывом артерии, это называется геморрагического инсульта3 , которая, в большинстве случаев, приводит к смерти. Когда тромб или эмболии препятствует кровотока, вызывая временное лишение кислорода и глюкозы в области ....
постнатального крысы (Sprague-Dawley) 1-4 дней старый используются для изоляции коре. Метод эвтаназия является обезглавливание, утвержденными руководящими принципами NIH.
1. Подготовка инструменты и материалы для хирургии
Одной из главных проблем первичной Астроцитарная культуры является наличие других клеток, нейронов, олигодендроциты, фибробластов и микроглии. На рисунке 1изолированных клеток от крыс коре были СМИ изменений каждые 3 дня и были либо необработанных или.......
Этот протокол описывает изоляции астроциты из крыса коре. В этом методе важно, чтобы уменьшить загрязнение с других клеточных типов, таких как микроглии, олигодендроциты и фибробластов. Чтобы уменьшить количество микроглии, некоторые шаги могут быть предприняты: изменение средств мас?.......
Авторы хотели бы поблагодарить Паола Лопес Pieraldi для оказания технической помощи. А выражает признательность за гранты 8G12MD007600 и U54-NS083924, которые поддержали эту публикацию. Мы благодарим низ-NIMHD-G12-MD007583 Грант Фонда поддержки. D.E.R.A. благодарен за стипендий, предоставляемых NIHNIGMS-R25GM110513. Мы благодарны за использование области общего инструментария и помощи доктора Присцила Санабриа для использования оптических изображений объекта RCMI программы путем предоставления G12MD007583. Кроме того мы хотим поблагодарить за его выдающуюся роль в съемки и редактирования visual протокол Хосе Падилья.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments for Surgery - Step 1 | |||
Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
DMEM Preparation - step 2 | |||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
Astrocyte culture - step 3 | |||
Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
OGD Medium Preparation - step 5 | |||
Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
primary astrocyte immunofluorescence - step 6 | |||
Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
Confocal microscope | Olympus |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved