Övervakning Astrocyten reaktivitet och spridning in Vitro ischemisk-liknande villkor

Summary

Ischemisk stroke är en komplex händelse där det specifika bidraget av astrocyter till hjärnregionen påverkas utsätts för syrebrist glukos (OGD) är svåra att studera. Den här artikeln presenteras en metod för att få isolerade astrocyter och studera deras reaktivitet och spridning OGD villkor.

Abstract

Ischemisk stroke är en komplex hjärnskada orsakad av en tromb eller emboli hindrar blodflödet till delar av hjärnan. Detta leder till berövande av syre och glukos, som orsakar energi fel och neuronala dödsfall. Efter en ischemisk stroke förolämpning, astrocyter blir reaktiva och föröka sig runt skadan webbplats som den utvecklas. Enligt detta scenario är det svårt att studera specifika bidrag av astrocyter till hjärnregionen utsätts för ischemi. Därför införs denna artikel en metod för att studera primära Astrocyten reaktivitet och spridning under en in vitro- modell av en ischemi-liknande miljö, kallas syre glukos deprivation (OGD). Astrocyter isolerades från 1-4 dag-gammal neonatala råttor och antalet icke-specifik astrocytic celler bedömdes med hjälp av Astrocyten selektiv markör Glial Fibrillary sura Protein (Fredsgenomförande) och nukleär färgning. Perioden som astrocyter underkastas villkoret OGD kan anpassas, liksom andelen syre som de utsätts för. Denna flexibilitet gör det möjligt för forskare att karakterisera varaktigheten av villkoret ischemisk-liknande i olika grupper av celler in vitro. I artikeln beskrivs de tidsramar för OGD som inducerar Astrocyten reaktivitet, hypertrofisk morfologi och spridning mätt med immunofluorescens använder frodas Cell nukleära Antigen (PCNA). Förutom spridning, astrocyter genomgå energi och oxidativ stress, och svara på OGD genom att släppa lösliga faktorer till cell medium. Detta medium kan samlas och används för att analysera effekterna av molekyler som släpptes av astrocyter i primära neuronala kulturer utan interaktion från cell till cell. I sammanfattning, kan här primär cell kultur modell användas effektivt att förstå rollen av isolerade astrocyter vid skada.

Introduction

Stroke definieras som ”en akut neurologisk dysfunktion av vaskulärt ursprung med antingen plötslig eller snabb utveckling av symtom och tecken, motsvarande medverkan av målområdena i hjärnan”^1,2. Det finns två typer av stroke: ischemisk och hemorragisk. När vaskulär dysfunktion orsakas antingen av ett aneurysm eller en arteriovenös fel, tillsammans med försvagning med bakre bristning av en artär, kallas detta hemorragisk stroke³ , som i de flesta fall leder till döden. När en tromb eller emboli hindrar blodflödet, kallas orsakar ett tillfälligt frihetsberövande av syre och glukos till e....

Protocol

postnatal råttor (Sprague Dawley) 1-4 dagar gamla används för att isolera cortices. Metoden för dödshjälp är halshuggning, som godkänts av NIH riktlinjer.

1. beredning av instrument och material för kirurgi

1. Sterilize instrument i autoklav (temperatur: 121 ºC, trycket: 15 psi, tid: 30 min) med en stål låda eller en omedelbar tätning sterilisering påse. Se material i Tabellen för material.

2. Slutföra DMEM förberedel.......

Discussion

Det här protokollet beskriver isolering av astrocyter från råtta cortices. Den här metoden är det viktigt att minska kontaminering med andra cellulära typer såsom mikroglia, oligodendrocyter och fibroblaster. För att minska antalet mikroglia, flera åtgärder kan vidtas: ändra media, orbital skakar och kemiska behandlingar. När kulturen renhet har bekräftats genom immunofluorescens med selektiv cellulära märkpennor eller för de mest framstående cell föroreningarna kan experiment utföras. Antikropp mot Jo.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus