Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Zebravisembryo's vormen een ideale experimenteel systeem om complexe morfogenetische processen te bestuderen vanwege hun gemakkelijke toegankelijkheid en optische transparantie. Vooral achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling waarbij meerdere weefsel vervormingen werken samen om de vorming van een groot deel van de lichaamsas sturen. Om dit proces te observeren door langdurige time-lapse imaging moet een bevestigingstechniek waarmee voldoende steun monsters in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en verkrijging gebruiken. Daarnaast moet de montage ook voldoende bewegingsvrijheid voor de uitgroei van de achterste lichaamsgebied zonder aantasting van de normale ontwikkeling. Tenslotte moet een zekere veelzijdigheid van de montagewijze beeldvormende worden vrijgemaakt voor diverse imaging setups. Hier presenteren we een bevestigingstechniek voor beeldvorming van de ontwikkeling van achterste lichaam elongation in de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl de achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. We zullen zien hoe dit kan worden aangepast voor rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie set-ups. Hoewel dit protocol is gericht op montage embryo's voor beeldverwerking met het achterste lichaam, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de live imaging meerdere aspecten van zebravis ontwikkeling.

Introduction

Achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling van het embryo zich een groot deel van de lichaamsas vormen. Het is een voorbeeld van een complex morfogenetisch proces waardoor meercellige gedrag optreden coördinerend de morfogenese op het niveau van afzonderlijke weefsels genereren. Deze differentiële weefsel vervormingen dan samenwerken om de verlenging van het achterste lichaam te genereren in de hele structuur niveau. Om te begrijpen hoe deze processen worden aangestuurd en gecoördineerd tijdens de ontwikkeling, moeten we in staat zijn om deze processen op verschillende schalen te volgen (dat wil zeggen op het niveau van moleculen,....

Protocol

1. Voorbereiding van de Solutions en trok glazen naald

1. Wordt 25x voorraadoplossing van tricaïne (3-amino benzoëzuurethylester, ook wel ethyl 3-aminobenzoaat) en 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 en breng deze oplossing bij pH 7. Aliquot van 4 ml en bewaar bij -20 ° C.
   LET OP: De verdoving tricaïne werkt bij voorkeur op neurale-voltage-gated natriumkanalen waardoor spiertrekkingen en beweging ⁶ blokkeren.
2. Maak een werkoplossing van tricaïne bij een uiteindelijke conce.......

Discussion

Deze montage techniek maakt het mogelijk embryo's nog steeds tijdens de overdracht aan de microscoop en op lange termijn time-lapse imaging experimenten gericht op het volgende achterste lichaam rek bij meerdere lengteschalen worden gehouden. Bovendien is veelzijdig doordat het zorgt voor beeldvorming zowel rechtop en ondersteboven microscopie opstellingen en een suggestie gedaan voor hoe dit verder kan worden aangepast om verticaal georiënteerde SPIM.

Een kritische stap in dit protocol.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo