Une méthode de montage polyvalent pour l'imagerie à long terme du développement Zebrafish

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

embryons de poisson zèbre offrent un système expérimental idéal pour étudier les processus morphogénétiques complexes en raison de leur facilité d'accès et de transparence optique. En particulier, l'allongement du corps postérieur est un processus essentiel dans le développement embryonnaire par lequel de multiples déformations des tissus agissent ensemble pour diriger la formation d'une grande partie de l'axe du corps. Afin d'observer ce processus en imagerie time-lapse à long terme, il est nécessaire d'utiliser une technique de montage qui permet un soutien suffisant pour maintenir les échantillons dans l'orientation correcte pendant le transfert au microscope et acquisition. En outre, le montage doit également assurer la liberté de mouvement suffisante pour l'excroissance de la région postérieure du corps sans affecter son développement normal. Enfin, il doit y avoir un certain degré de polyvalence de la méthode de montage pour permettre l'imagerie sur diverses imagerie set-ups. Ici, nous présentons une technique de montage pour l'imagerie du développement du corps postérieur elongation dans le zebrafish D. rerio. Cette technique implique des embryons de telle sorte que les régions tête et jaune sac sont presque entièrement inclus dans agarose de montage, tout en laissant la région postérieure du corps pour allonger et se développer normalement. Nous allons montrer comment cela peut être adapté à la verticale, inversé et vertical microscopie optique-feuille set-ups. Bien que ce protocole met l'accent sur les embryons pour l'imagerie du corps postérieur de montage, il pourrait facilement être adapté pour l'imagerie en direct de plusieurs aspects du développement du poisson zèbre.

Introduction

Postérieur corps d'allongement est un processus essentiel dans le développement embryonnaire de l'embryon qui se prolonge pour former une partie importante de l'axe du corps. Il est un exemple d'un processus complexe par lequel morphogénétique comportements cellulaires multiples agissent de façon coordonnée pour générer la morphogenèse au niveau des tissus individuels. Ces déformations du tissu différentiel agissent alors ensemble pour produire l'allongement du corps postérieur au niveau de l'ensemble de la structure. Pour comprendre comment ces processus sont contrôlés et coordonnés au cours du développement, nous devons être en mesure de sui....

Protocol

1. Préparation des solutions et Pulled Verre aiguille

1. Faire une solution 25x stock de Tricaine (3-amino ester éthylique de l'acide benzoïque, également appelé le 3-aminobenzoate) à 4 mg / ml dans 20 mM Tris pH 8,8 et apporter cette solution est à pH 7. aliquote de 4 ml et conserver à -20 ° C.
   NOTE: L'anesthésie Tricaine agit de préférence sur les canaux sodiques voltage-dépendants neuronaux bloquant ainsi des contractions musculaires et le mouvement ^6.
.......

Discussion

Cette technique de montage permet embryons à conserver encore pendant le transfert au microscope et plus des expériences d'imagerie time-lapse à long terme visant à la suite postérieure allongement du corps à des échelles de longueur multiples. En outre, il est souple en ce qu'elle permet d'imagerie sur la microscopie en position verticale et inversée set-up, et une suggestion est faite pour savoir comment cela peut être adapté en outre pour SPIM orienté verticalement.

.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo