Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Zebrabärbling-Embryonen bieten eine ideale experimentelle System komplexe morphogenetischen Prozesse zu untersuchen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und optische Transparenz. Insbesondere ist hintere Körperdehnung ein wesentlicher Prozess in der embryonalen Entwicklung, durch die Verformungen mehrere Gewebe zusammen, um die Bildung eines großen Teils der Körperachse zu lenken handeln. Um diesen Prozess durch langfristige Zeitraffer-Bildgebung zu beobachten, ist es notwendig, eine Montagetechnik zu verwenden, die ausreichende Unterstützung ermöglicht es, Proben in der richtigen Ausrichtung während der Übertragung an das Mikroskop und den Erwerb zu halten. Darüber hinaus muss die Montage bieten auch ausreichende Bewegungsfreiheit für das Auswachsen des hinteren Körperbereich ohne seine normale Entwicklung zu beeinflussen. Schließlich muss ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montage Methode, um Bildgebung auf verschiedenen Abbildungsaufbauten ermöglichen. Hier präsentieren wir eine Montagetechnik für die Abbildung der Entwicklung des hinteren Körpers Elongation in der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen, so dass der Kopf und Dottersack Regionen sind fast vollständig in Agarose enthalten, während das Weglassen der hinteren Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Wir werden zeigen , wie sich dies für aufrecht, umgekehrt und vertikale Lichtbogen - Mikroskopie - Set-ups angepasst werden. Während dieses Protokoll Embryonen für die Bildgebung bei der Montage für den hinteren Körper konzentriert, könnte es leicht für die Live-Bildgebung von mehreren Aspekten der Zebrabärblingentwicklung angepasst werden.

Introduction

Posterioren Körper Dehnung ist ein wesentlicher Prozess bei der Embryonalentwicklung, durch die der Embryo ein großer Teil der Körperachse zu bilden, erstreckt. Es ist ein Beispiel eines komplexen morphogenetic Prozess, bei dem mehrere Zellverhalten koordinativ die Morphogenese auf der Ebene der einzelnen Gewebe zu erzeugen, wirken. Diese unterschiedlichen Gewebedeformationen dann zusammen wirken, um die Dehnung des hinteren Körpers an der gesamten Strukturebene zu erzeugen. Um zu verstehen , wie diese Prozesse werden gesteuert , und während der Entwicklung koordiniert, müssen wir in der Lage sein , diese Verfahren bei mehreren Skalen zu folgen (dh auf der E....

Protocol

1. Herstellung von Lösungen und Pulled Glasnadel

1. Machen Sie eine 25x Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, die auch als Ethyl-3-aminobenzoat) bei 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 und bringen diese Lösung bei pH 7. Aliquot von 4 ml und an einem -20 ° C.
   HINWEIS: Das Anästhetikum Tricaine wirkt bevorzugt auf neuronalen spannungsgesteuerten Natriumkanäle dadurch blockiert Muskelzuckungen und Bewegung ^6.
2. Machen Sie eine Arbeitslösung von Tricaine b.......

Discussion

Diese Befestigungstechnik ermöglicht Embryonen noch während der Übertragung an das Mikroskop und über an folgenden hinteren Körperdehnung mehrere Längenskalen dem Ziel eines langfristigen Zeitraffer-Imaging Experimente gehalten werden. Darüber hinaus ist es vielseitig, dass sie für die Bildgebung auf beiden aufrechten und der inversen Mikroskopie Aufbauten erlaubt, und ein Vorschlag gemacht wird, wie dies weiter vertikal ausgerichtet SPIM angepasst werden.

Ein entscheidender Schritt .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo