שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

עוברי דג זברה להציע מערכת ניסיונית אידיאלית ללמוד תהליכים מורכבים המוךפו"גנטי שהולכים בשל קלויות נגישות ושקיפות אופטית שלהם. בפרט, התארכות גוף האחורי הוא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו דפורמציות רקמות מרובות לפעול יחד כדי לכוון את ההיווצרות של חלק גדול של ציר הגוף. על מנת להתבונן בתהליך זה על ידי הדמיה לטווח ארוכת זמן לשגות יש צורך לנצל טכניקת הרכבה המאפשרת תמיכה מספקת כדי לשמור על דגימות בכיוון הנכון במהלך העברת המיקרוסקופ והרכישה. בנוסף, ההרכבה חייבת גם לספק חופש מספיק תנועה של התולדה של אזור הגוף האחורי מבלי להשפיע ההתפתחות התקינה שלו. לבסוף, חייב להיות מידה מסוימת ב צדדי של שיטת ההרכבה לאפשר הדמיה על סט-אפ הדמיה המגוון. כאן, אנו מציגים טכניקת הרכבת הדמיה בפיתוח elongatio גוף האחוריn של דג הזברה ד rerio. טכניקה זו כרוכה הרכבה עוברת כך אזורי צק הראש והחלמון כמעט כלולים כולו agarose, ומותיר מחוץ לו באזור הגוף האחורי להאריך ולהתפתח באופן תקין. אנו נראים כיצד זה יכול להיות מותאם עבור קופצים להגדיר מיקרוסקופ זקוף, הפוך ואנכי אור גיליון. בעוד פרוטוקול זה מתמקד הרכבה עוברת הדמיה של הגוף האחורי, זה יכול בקלות להיות מותאם עבור הדמית החיה של היבטים רבים של פיתוח דג זברה.

Introduction

התארכות גוף האחורית היא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו העובר משתרע מהווה חלק גדול של ציר הגוף. זוהי דוגמא של תהליך מורכב המוךפו"גנטי שהולך שבאמצעותו התנהגויות תאים מרובות לפעול בצורה מתואמת כדי ליצור את morphogenesis ברמה של רקמות פרט. דפורמציות רקמות הפרש אלה ולאחר מכן לפעול יחד כדי ליצור את ההתארכות של הגוף האחורי ברמת המבנה כולו. כדי להבין כיצד תהליכים אלה נשלטים ומתואמים במהלך פיתוח, אנחנו חייבים להיות מסוגלים לעקוב אחר התהליכים האלה בקני מידה מרובות (כלומר ברמה של מולקולות, תאים, אוכלוסיות תאים ורקמות) ולהתייחס זה ישירות morphogenesis של המבנה כולו .

Protocol

1. הכנת פתרונות ומשך מחט זכוכית

1. הכן פתרון מניות 25x של Tricaine (3-אמינו אתיל אסתר חומצה בנזואית, המכונה גם אתיל 3-aminobenzoate) בשעה 4 מ"ג / מ"ל ​​ב 20 מ"מ טריס pH 8.8 ולהביא פתרון זה ב- pH 7. Aliquot ב -4 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
   הערה: Tricain.......

Discussion

טכניקה זו מאפשרת הרכבה עוברת להישמר עדיין במהלך העברת המיקרוסקופ ושוב לטווח ארוך ניסויי הזמן לשגות הדמיה שמטרתה הבאה התארכות גוף אחורית בסקאלות אורך המרובה. יתר על כן, זה הוא תכליתי בכך שהיא מאפשרת הדמיה משני מיקרוסקופיה זקוף הפוך בחרו קופץ, וכן המלצה ניתנת למען איך .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo