Zebrafish विकास की लॉन्ग टर्म इमेजिंग के लिए एक बहुमुखी बढ़ते विधि

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Zebrafish भ्रूण पहुंच और ऑप्टिकल पारदर्शिता के अपने आसानी के कारण जटिल morphogenetic प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रायोगिक प्रणाली की पेशकश करते हैं। विशेष रूप से, पीछे शरीर बढ़ाव भ्रूण विकास है जिसके द्वारा कई ऊतक विकृतियों एक साथ कार्य शरीर धुरी के एक बड़े हिस्से के गठन को निर्देशित करने में एक आवश्यक प्रक्रिया है। आदेश में लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग द्वारा इस प्रक्रिया का पालन करने के लिए यह एक बढ़ते तकनीक है कि पर्याप्त समर्थन माइक्रोस्कोप और अधिग्रहण करने के लिए स्थानांतरण के दौरान सही ओरिएंटेशन में नमूने बनाए रखने के लिए अनुमति देता है का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, बढ़ते भी अपनी सामान्य विकास को प्रभावित किए बिना पीछे शरीर क्षेत्र के परिणाम के लिए आंदोलन की पर्याप्त स्वतंत्रता प्रदान करनी चाहिए। अंत में, वहाँ विविध इमेजिंग सेट-अप पर इमेजिंग अनुमति देने के लिए बढ़ते विधि की चंचलता में एक निश्चित डिग्री होना चाहिए। यहाँ, हम पीछे शरीर elongatio के विकास इमेजिंग के लिए एक बढ़ते तकनीक मौजूद हैn zebrafish डी rerio में। इस तकनीक को भ्रूण ऐसी है कि सिर और जर्दी थैली क्षेत्रों लगभग पूरी तरह से agarose में शामिल किए गए हैं बढ़ते, जबकि पीछे शरीर क्षेत्र से बाहर जा रही बढ़ाना और सामान्य रूप से विकसित करने के लिए शामिल है। हम दिखा देंगे कि यह कैसे, ईमानदार औंधा और ऊर्ध्वाधर प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी सेट-अप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के पीछे शरीर के लिए इमेजिंग के लिए भ्रूण बढ़ते पर केंद्रित है, यह आसानी से zebrafish विकास के कई पहलुओं का जीना इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

पोस्टीरियर शरीर बढ़ाव जिसके द्वारा भ्रूण शरीर धुरी के एक बड़े हिस्से के रूप में फैली भ्रूण के विकास में एक अनिवार्य प्रक्रिया है। यह एक जटिल प्रक्रिया है जिसके द्वारा मॉर्फ़ोजेनेटिक कई सेल व्यवहार coordinately कार्य व्यक्ति के ऊतकों के स्तर पर morphogenesis उत्पन्न करने का एक उदाहरण है। ये अंतर ऊतक विकृतियों फिर एक साथ कार्य पूरे ढांचे के स्तर पर पीछे शरीर के बढ़ाव उत्पन्न करते हैं। समझ कैसे इन प्रक्रियाओं को नियंत्रित और विकास के दौरान समन्वय कर रहे हैं, हम (अणु, कोशिकाओं, सेल आबादी और ऊतकों के स्तर पर यानी) कई पैमानों पर इन प्रक्रियाओं का पालन करने में सक्षम होना चाहिए और पूरे ढांचे के morphogenesis के लिए सीधे इस से संबद्ध करने की ।

Protocol

1. समाधान की तैयारी और खींच लिया गिलास सुई

1. 20 मिमी Tris पीएच 8.8 में 4 मिलीग्राम / एमएल Tricaine (3 अमीनो benzoic एसिड एथिल एस्टर, यह भी कहा जाता एथिल 3-aminobenzoate) के एक 25x शेयर समाधान करें और लाने कि समाधान पीएच पर है 7. 4 एमएल और दु?.......

Discussion

इस बढ़ते तकनीक के लिए सक्षम बनाता भ्रूण माइक्रोस्कोप और अधिक से अधिक लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग प्रयोगों कई लंबाई पैमाने पर पीछे शरीर बढ़ाव निम्नलिखित के उद्देश्य के लिए स्थानांतरण के दौरान अभी भी ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo