ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

ゼブラフィッシュの胚は、アクセシビリティと光透過性の容易さのために複雑な形態形成過程を研究するための理想的な実験系を提供しています。具体的には、後部ボディ伸びは、複数の組織変形が体軸の大部分の形成を指示するために一緒に作用することにより、胚発生に不可欠なプロセスです。長期タイムラプス撮影することによって、このプロセスを観察するためには、十分な支持を顕微鏡及び取得に転送中に正しい方向で試料を維持することを可能にする実装技術を利用する必要があります。また、実装は、その正常な発達に影響を与えることなく、後部ボディ領域の伸長のための運動の十分な自由度を提供しなければなりません。最後に、多様なイメージング・セットアップにイメージングを可能にするために、実装方法の汎用性がある程度存在しなければなりません。ここでは、後部本体の開発を画像化するための実装技術を提供elongatioゼブラフィッシュD.レリオ中のn。この技術は、細長く、正常に発育する後部ボディ領域を残して、ヘッドと卵黄嚢の領域をほぼ完全にアガロース中に含まれるように胚をマウントすることを含みます。これは、直立反転および垂直光シート顕微鏡セットアップのために適合させることができる方法を紹介します。このプロトコルは、後部ボディ用イメージングのための胚をマウントするに焦点を当てているが、それは簡単にゼブラフィッシュの開発のさまざまな側面のライブイメージングのために適合させることができます。

Introduction

後部ボディ伸びが胚体軸の大部分を形成するように延びていることにより、胚発生に不可欠なプロセスです。これは、複数の細胞の挙動は、個々の組織のレベルでの形態形成を生成するために協調的に作用することにより、複雑な形態形成過程の一例です。これらの差動組織変形は、その後、構造全体のレベルで後部本体の伸長を生成するために一緒に働きます。これらのプロセスが制御され、現像時に調整されている方法を理解するために、我々は（分子、細胞、細胞集団と組織のレベルでIE）複数のスケールで、これらのプロセスに従うことができなければならず、全体の構造の形態形成に直接これを関連付けること。

その光学的透明性と小さなサイズは、最小侵襲性光イメージングのアプリケーションを可能にするようゼブラフィッシュの胚は、LIVによく適して近づいイメージング後部本体の伸長のために理想的です電子イメージング。 ¹これは、分子のレベル^、2単セルで^、3と間組織行動^、4だけでなく、細胞集団全体の臓器のレベルで後部本体の開発に光を当てるしている最近の一連の刊行物によって証明されています。 ⁵

このような共焦点、多光子顕微鏡法およ....

Protocol

1.溶液の調製とプルガラスニードル

1. 20 mMトリスpHを8.8に4ミリグラム/ mLでトリカイン（3-アミノ安息香酸エチルエステルとも呼ばれる3-アミノ安息香酸エチル）の25倍ストック溶液を作成し、そのソリューションはpHである4 mLおよび店舗7.小分けに持ち込みます-20℃。
   注：麻酔トリカイン、それによって筋肉のけいれんや運動^6を遮断^する神経電位?.......

Discussion

この実装技術は、胚は、顕微鏡、複数の長さスケールで後部ボディ伸びを以下のことを目的としたオーバー長期的タイムラプスイメージング実験への転送中に静止保持することができます。それは両方の直立および反転の顕微鏡セットアップのイメージングを可能にし、提案が、これはさらに垂直に向けSPIMに適合させることができる方法のために作られているという点でまた、多目的です。.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo