Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

embriões de peixe-zebra oferecer um sistema experimental ideal para estudar processos morfogenéticos complexas devido à sua facilidade de acessibilidade e transparência óptica. Em particular, o alongamento do corpo posterior é um processo essencial do desenvolvimento embrionário, através da qual múltiplos deformações tecido agir em conjunto para dirigir a formação de uma grande parte do eixo do corpo. A fim de observar esse processo por meio de imagens de lapso de tempo de longo prazo, é necessário utilizar uma técnica de montagem que permite um apoio suficiente para manter amostras na orientação correta durante a transferência para o microscópio e aquisição. Além disso, a montagem também deve proporcionar liberdade suficiente de movimento para a excrescência da região do corpo posterior, sem afectar o seu desenvolvimento normal. Finalmente, deve haver um certo grau de versatilidade do método de montagem para permitir a imagiologia em diversas imagem set-ups. Aqui, apresentamos uma técnica de montagem para a imagiologia do desenvolvimento de posterior elongatio corpon no peixe-zebra D. rerio. Esta técnica envolve a montagem de embriões de tal forma que as regiões da cabeça e do saco vitelino são quase inteiramente incluídas no agarose, deixando de fora região do corpo posterior para alongar e desenvolver normalmente. Vamos mostrar como isso pode ser adaptado para microscopia de luz folhas na vertical, invertida e vertical set-ups. Embora este protocolo centra-se na montagem de embriões para a imagem latente para o corpo posterior, poderia ser facilmente adaptado para a imagem ao vivo de vários aspectos do desenvolvimento do peixe-zebra.

Introduction

Posterior alongamento corpo é um processo essencial do desenvolvimento embrionário em que o embrião se estende de modo a formar uma grande parte do eixo do corpo. É um exemplo de um processo morfogenético complexo, através da qual vários comportamentos de células agir coordenadamente para gerar a morfogénese no nível de tecidos individuais. Estas deformações tecido diferencial, em seguida, actuar em conjunto para gerar o alongamento do corpo posterior em todo o nível da estrutura. Para entender como esses processos são controlados e coordenados durante o desenvolvimento, que deve ser capaz de seguir esses processos em múltiplas escalas (ou seja, no nível de ....

Protocol

1. Preparação de Soluções e puxou vidro Needle

1. Adicione uma solução de estoque de 25x tricaina (3-amino éster de etilo do ácido benzóico, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato de metilo) a 4 mg / mL em Tris 20 mM, pH 8,8 e trazer esta solução é a pH 7. alíquota, de 4 ml e armazenar a -20 ° C.
   NOTA: O tricaina anestésico actua preferencialmente nos canais de sódio dependentes da voltagem neurais bloqueando assim espasmos musculares e movimento ^6.
2. .......

Discussion

Esta técnica de montagem permite que embriões que permanecer estática durante a transferência para o microscópio e mais experimentos com imagens de lapso de tempo de longo prazo destinadas a seguinte alongamento do corpo posterior em várias escalas de comprimento. Além disso, é versátil na medida em que permite a imagem em microscopia invertida na vertical e fixados-ups, e uma sugestão é feita para como isto pode ser ainda adaptado para SPIM orientada verticalmente.

Um passo essen.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo