Универсальный способ крепления для Long Term Визуализация данио развития

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Эмбрионы рыбок данио предлагают идеальную экспериментальную систему для изучения сложных морфогенетических процессов из-за легкости их доступности и оптической прозрачности. В частности, удлинение задний корпус является важным процессом эмбрионального развития, с помощью которых множественные деформации ткани действуют вместе, чтобы направлять формирование значительной части оси тела. Для того чтобы наблюдать этот процесс долгосрочного покадровой обработки изображений необходимо использовать монтажную технику, которая позволяет достаточную поддержку, чтобы сохранить образцы в правильной ориентации во время передачи в микроскоп и приобретения. Кроме того, крепление должно также обеспечить достаточную свободу движения для разрастания области тела заднего, не влияя на его нормальное развитие. Наконец, должна быть определенная степень в универсальности метода монтажа, чтобы позволить визуализацию на различных изображений наборах. Здесь мы представляем монтажную технику для визуализации развития заднего elongatio телап в данио D. rerio. Этот метод включает в себя монтаж эмбрионов таким образом, что участки головы и желтка почти полностью включены в агарозы, оставляя вне области тела задней удлиняется и нормально развиваться. Мы покажем , как это может быть адаптирована для вертикально, перевернутый и вертикальной световой микроскопии листа Наладки. Хотя этот протокол фокусируется на монтаже эмбрионов для визуализации для заднего тела, она легко может быть адаптирована для живого изображения нескольких аспектов данио развития.

Introduction

Задней тела удлинение является важным процессом в эмбриональном развитии, с помощью которого эмбрион простирается, чтобы сформировать большую часть оси тела. Это является примером сложного морфогенетического процесса, с помощью которого несколько поведение ячеек действуют скоординировано для генерации морфогенез на уровне отдельных тканей. Эти деформации дифференциальной ткани затем действовать вместе, чтобы сформировать удлинение заднего тела на уровне целого структуры. Для того, чтобы понять , каким образом контролируются и координируются в процессе развития этих процессов, мы должны быть в состоянии следовать за этими процессами в различных масштабах (т.е.

Protocol

1. Приготовление растворов и потянула Стекло иглы

1. Сделать 25х исходный раствор Tricaine (3-амино-этиловый эфир бензойной кислоты, называемый также этиловый эфир 3-аминобензойной кислоты) в дозе 4 мг / мл в 20 мМ Трис, рН 8,8, и довести, что раствор при рН 7. аликвоты с помощью 4 мл и хранят при -20 .......

Discussion

Эта монтажная техника позволяет эмбрионы должны храниться до сих пор в процессе передачи на микроскоп и более долгосрочных экспериментов покадровой обработки изображений, направленных на следующие заднего удлинения тела в различных масштабах длины. Кроме того, он является универсал.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo