Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

embriones de pez cebra ofrecen un sistema experimental ideal para estudiar los procesos morfogenéticos complejos debido a su facilidad de acceso y la transparencia óptica. En particular, la elongación posterior del cuerpo es un proceso esencial en el desarrollo embrionario mediante el cual múltiples deformaciones de tejido actúan juntos para dirigir la formación de una gran parte del eje del cuerpo. Con el fin de observar este proceso mediante formación de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, es necesario utilizar una técnica de montaje que permite un apoyo suficiente para mantener las muestras en la orientación correcta durante la transferencia al microscopio y de adquisición. Además, el montaje también debe proporcionar la suficiente libertad de movimiento para la derivación de la región posterior del cuerpo sin afectar su desarrollo normal. Por último, debe haber un cierto grado de versatilidad del método de montaje para permitir la formación de imágenes en diversas imágenes set-ups. A continuación, presentamos una técnica de montaje para obtener imágenes del desarrollo de elongatio posterior del cuerpon en el pez cebra D. rerio. Esta técnica consiste en embriones de tal manera que las regiones de la cabeza y del saco vitelino son casi en su totalidad incluidos en agarosa de montaje, dejando fuera de la región posterior del cuerpo para alargar y desarrollarse normalmente. Vamos a mostrar cómo esto puede ser adaptado para su posición vertical, invertida y vertical de la ficha técnica de microscopía de luz montajes. Si bien este protocolo se centra en los embriones para obtener imágenes de la parte posterior del cuerpo de montaje, que podría adaptarse fácilmente para la formación de imágenes en vivo de varios aspectos del desarrollo del pez cebra.

Introduction

Posterior elongación cuerpo es un proceso esencial en el desarrollo embrionario en la que el embrión se extiende para formar una gran parte del eje del cuerpo. Es un ejemplo de un proceso morfogenético complejo mediante el cual múltiples comportamientos celulares actúan coordinadamente para generar la morfogénesis en el nivel de los tejidos individuales. Estas deformaciones de tejido diferencial entonces actúan juntos para generar el alargamiento del cuerpo posterior en todo el nivel de la estructura. Para entender cómo estos procesos son controlados y coordinados durante el desarrollo, debemos ser capaces de seguir estos procesos en múltiples escalas (es decir,<....

Protocol

1. Preparación de soluciones y sacó la aguja de cristal

1. Hacer una solución 25x social de Tricaína (3-amino éster etílico del ácido benzoico, también llamado acetato de 3-aminobenzoato) a 4 mg / ml en 20 mM Tris pH 8,8, y llevar esa solución es a pH 7. Una alícuota de 4 ml y almacenar a -20 ° C.
   NOTA: El Tricaína anestésico actúa preferentemente sobre los canales de sodio dependientes de voltaje neuronales bloqueando así espasmos musculares y el movimiento ^6.
.......

Discussion

Esta técnica de montaje permite que los embriones que se le mantenga aún durante la transferencia al microscopio y más de los experimentos de imagen de lapso de tiempo a largo plazo destinados a la elongación posterior del cuerpo después en múltiples escalas de longitud. Además, es versátil en que permite la formación de imágenes en ambos microscopía en posición vertical e invertida montajes, y una sugerencia se hace para cómo esto puede ser adaptado además para SPIM orientado verticalmente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo