Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Zebra balığı embriyolar nedeniyle erişilebilirlik ve optik şeffaflık kolaylığı karmaşık morfogenetik süreçleri incelemek için ideal bir deneysel sistem sunuyoruz. Özellikle, arka gövde uzama çoklu doku deformasyonları vücut ekseninin büyük bir kısmı oluşumunu yönlendirmek için birlikte hareket hangi embriyonik gelişiminde önemli bir süreçtir. Uzun vadeli time-lapse görüntüleme ile bu süreci gözlemlemek için yeterli destek mikroskop ve iktisap transferi sırasında doğru yönde örnekleri korumak için izin veren bir montaj tekniği kullanmak gerekir. Buna ek olarak, montaj aynı zamanda normal gelişimini etkilemeden arka gövde bölgenin büyümesi için yeterli hareket özgürlüğü sağlamak zorundadır. Son olarak, çeşitli görüntüleme set-up üzerinde görüntüleme izin montaj yönteminin çok yönlülüğü de belirli bir ölçüde olması gerekir. Burada, arka gövde elongatio gelişimini görüntüleme için bir montaj tekniği sunmakn Zebra balığı D. rerio içinde. Bu teknik uzatmak ve normalde geliştirmek için arka gövde bölgeyi dışarı çıkarken, baş ve yolk kesesi bölgeleri neredeyse tamamen agaroz dahildir şekilde embriyoların montaj içerir. Biz bu dik, ters ve dikey ışık sayfalık mikroskopisi set-up için adapte edilebilir gösterecektir. Bu protokol posterior vücut için görüntüleme için embriyolar montaj odaklanırken, kolayca zebrabalıkları gelişmenin birden yönlerini canlı görüntüleme için adapte edilebilir.

Introduction

Arka gövde uzama embriyo vücut eksenine büyük bir kısmını oluşturmak üzere uzandığı tarafından embriyonik gelişiminde önemli bir süreçtir. Bu, birden fazla hücre davranışları Bireysel dokular düzeyinde morfonogenezi oluşturmak için koordineli hareket hangi kompleks morfogenetik işlemin örneğidir. Bu diferansiyel doku deformasyonları sonra bütün yapı düzeyinde posterior vücudun uzamasını oluşturmak için birlikte hareket. Bu süreçler kontrollü ve gelişme sırasında koordine nasıl anlamak için, (moleküller, hücreler, hücre popülasyonlarının ve dokuların düzeyinde yani), birden ölçeklerde bu süreçleri takip etmek gerekir ve tüm yapının morfonogenezi doğrudan iliş....

Protocol

1. Çözelti Hazırlanması ve çekti Cam İğne

1. 20 mM Tris pH 8.8 içinde 4 mg / mL Tricaine (3-amino-benzoik asit etil ester, aynı zamanda adı etil 3-aminobenzoat) içindeki bir 25x stok çözeltisi yapmak ve bu çözelti, pH 4 mL mağaza tarafından 7. kısım en getirmek -20 ° C.
   NOT: anestetik Tricaine böylece kas seğirmesi ve hareketi ⁶ engelleme nöral voltaj bağımlı sodyum kanalları tercihen hareket eder.
2. E3 embriyo ortam içinde 0.17 mg / ml'lik b.......

Discussion

Bu montaj tekniği embriyoların mikroskop ve çoklu uzunluk ölçeklerinde arka gövde uzama aşağıdaki amaçlayan üzerinde uzun vadeli zaman atlamalı görüntüleme deneyleri transferi sırasında hareketsiz tutulması sağlar. her iki dik olarak ters çevrilmiş mikroskop set up üzerinde görüntüleme sağlar ve bir öneri, bu daha dikey yönlendirilmiş SPIM uyarlanabilir nasıl yapılması ile Ayrıca, çok yönlüdür.

Bu protokol kritik bir adım, bu yapının normal gelişimini.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo