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Resumen

Las imágenes de células vivas de las células sanguíneas etiquetadas en la circulación ocular pueden proporcionar información sobre la inflamación y la isquemia en la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Se describe un protocolo para etiquetar células sanguíneas e imágenes de las células marcadas en la circulación retiniana.

Resumen

La dinámica del flujo sanguíneo retinal y coroideo puede proporcionar una visión de la fisiopatología y secuelas de diversas enfermedades oculares, como el glaucoma, la retinopatía diabética, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y otras afecciones inflamatorias oculares. También puede ayudar a controlar las respuestas terapéuticas en el ojo. El etiquetado adecuado de las células sanguíneas, junto con la obtención de imágenes de células vivas de las células marcadas, permite investigar la dinámica del flujo en la circulación retinal y coroidea. Aquí, se describen los protocolos estandarizados de 1,5% indocyanine green (ICG) y 1% fluoresceína de sodio etiquetado de ratones eritrocitos y leucocitos, respectivamente. Se aplicó una oftalmoscopia láser de exploración (SLO) para visualizar las células marcadas en la circulación retiniana de ratones C57BL / 6J (tipo salvaje). Ambos métodos demostraron distintas células marcadas con fluorescencia en la circulación retiniana del ratón. Estos métodos de etiquetado pueden tener aplicaciones más amplias en diversas enfermedades ocularesModelos.

Introducción

El estudio de la dinámica de flujo de las células sanguíneas en la retina y la circulación coroidea es imprescindible para comprender la patogénesis de las enfermedades oculares potencialmente amenazadoras de la visión y otras afecciones inflamatorias oculares. Sin embargo, las técnicas de angiografía convencionales, que implican la unión de colorantes fluorescentes a proteínas plasmáticas, no proporcionan ninguna información con respecto a la dinámica de los eritrocitos o leucocitos 1 . La dinámica del flujo retiniano eritrocitario es importante para el estudio de la circulación metabólicamente eficiente en la retina y la dinámica del flujo leucocitario, para comprender la migración celular, el reconocimiento, la adhesión y la destrucción en diversas condiciones inflamatorias. Existen varias moléculas fluorescentes utilizadas en la identificación y caracterización de diversos tipos de células 3 . La hemodinámica de las células sanguíneas puede medirse teñiéndolas con las fluorescentes apropiadasY aplicar las técnicas de imagen adecuadas 4 .

La presencia de respuestas inflamatorias en las enfermedades intraoculares como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la retinopatía diabética (DR) implican la acumulación de linfocitos en el área enferma 5 , 6 . El seguimiento de las células inmunes en los tejidos puede ayudar a entender los complejos eventos involucrados en el mecanismo de la patogénesis de la enfermedad. Isótopos radiactivos como 51 Cr y 125 I se utilizaron como trazadores celulares en los primeros estudios. Estos colorantes son tóxicos y afectan la viabilidad celular. Aunque los marcadores radioactivos 3H y 14C son menos tóxicos para las células, debido a sus energías de emisión más bajas, es difícil detectar sus señales en el sistema 7 , 8 . Se introdujeron una serie de colorantes fluorocromos para superar los problemas potenciales asociados wCon marcadores radioactivos y seguimiento de la migración de linfocitos in vitro utilizando microscopía fluorescente y citometría de flujo [ 9 , 10] . Hoechst 33342 y naranja de tiazol son colorantes fluorescentes de unión al ADN, que se usan para rastrear linfocitos in vivo. Hoechst 33342 se une a regiones ricas en AT en el ADN, es permeable a la membrana, retiene las señales fluorescentes durante 2 - 4 días y es resistente al enfriamiento 9 , 10 . Las desventajas de Hoechst 33342 y tiazol naranja son la inhibición de la proliferación de linfocitos 11 y la semivida corta, respectivamente 9 .

Calcein-AM, diacetato de fluoresceína (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (y 6) -carboxifluoresceína, éster acetoximetilico (BCECF-AM), 5- (y 6) Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) y éster acetoximetilico de diacetato de 5- (y 6) - carboxifluoresceína (CFDA - AM)Son los colorantes fluorescentes citoplasmáticos utilizados para estudios de migración de linfocitos. Sin embargo, FDA, CFDA y CFDA-AM tienen menor retención en las células [ 9] . BCECF-AM reduce la respuesta proliferativa e influye en la quimiotaxis y la producción de superóxido 9 , 12 . Calcein-AM es un colorante fluorescente y útil para estudios de migración de linfocitos in vivo a corto plazo. Emite señales fluorescentes fuertes, no interfiere con la mayoría de las funciones celulares y retiene las señales fluorescentes hasta por 3 días 12 , 13 . El isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA-SE) son colorantes fluorescentes de acoplamiento covalentes, que se usan para estudios de migración de linfocitos. FITC no muestra ningún efecto sobre la viabilidad celular y tiene una mayor afinidad con los linfocitos B que los linfocitos T 14 , 15 in vivo durante más de 8 semanas y hasta 8 divisiones celulares 9 , 16 . Dihidrato de C _ {18} Di (dihidrato de 1,1 '- dioctadecil - 3,3,3', 3 '- tetrametilindocarbocianina), DiO (perclorato de 3,3' - dioctadeciloxacarbocianina), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 y PKH26, Insertando tintes fluorescentes de carbocianina lipófilos usados ​​para marcar leucocitos y eritrocitos. C18 Dil y DiO exhiben señales más altas cuando se incorporan en la membrana celular y son relativamente no tóxicos 12 , 17 . Las células marcadas con PKH2, PKH3 y PKH26 exhiben una buena retención de las señales fluorescentes con menos toxicidad 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Sin embargo, PKH2 regula la expresión de CD62L y reduce Viabilidad de los fmocitos 23 .

La mayoría de los estudios mencionados anteriormente se han realizado para rastrear la migración y proliferación de linfocitos en los linfáticos y estudiar los eritrocitos marcados en la circulación no ocular. Hay muy pocos estudios que apliquen las técnicas de etiquetado para estudiar las células sanguíneas en la circulación ocular. Aplicación de la oftalmoscopia láser de escaneo (SLO) tiene una gran ventaja en el estudio de las células etiquetadas en la retina y la circulación coroidea in vivo por fundus angiografía [ 24] . Existen varios colorantes fluorescentes, tales como ICG, naranja de acridina, FITC, fluoresceína sódica y CFDA que se usan para estudiar los leucocitos en la circulación retiniana por SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Clase 31,32,33,34. La fototoxicidad y la carcinogenicidad de la naranja de acridina 26,27, la interferencia de FITC con la actividad celular y la necesidad de un agente de contraste intravascular para la resolución de los vasos sanguíneos retinianos y coroideos limita su aplicación en experimentos con animales in vivo 29 . La fluoresceína sódica y el ICG son no tóxicos, aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos, y son seguros para las pruebas en seres humanos 32 , 35 . La mayoría de los estudios dinámicos de flujo están relacionados con el etiquetado de los leucocitos o eritrocitos y su visualización en los vasos sanguíneos retinales y coroides 36 , 37 , 38 , 39

Protocolo

Los protocolos de animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth, Singapur y están de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el Uso de Animales en Oftalmología y Visión Investigación.

1. Etiquetado de eritrocitos y leucocitos con colorantes fluorescentes

  1. Preparación de reactivos
    1. Preparar ICG (1,5 mg / ml) disolviendo 3 mg de ICG en 1800 μl de agua destilada esterilizada. Añadir 200 μl de solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS).
    2. Preparar 40% 1x PBS añadiendo 4 mL de 1x PBS a 6 mL de agua destilada esterilizada. Preparar 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS añadiendo 100 mg de BSA a 10 ml de 1x PBS. Mezclar bien hasta que se disuelva la BSA.
  2. Aislamiento de eritrocitos y leucocitos mediante centrifugación en gradiente de densidad
    1. Anestesiar los ratones (wild tyPe C57BL / 6) utilizando una combinación de clorhidrato de ketamina (50 mg / kg) y clorhidrato de xilazina (0,5 mg / kg) (según el esquema 1, según las directrices de ARVO). Confirme la anestesia mediante el reflejo de retirada del pedal (p. Ej .
    2. Inserte lentamente la aguja de calibre 29 (unida a una jeringa de 1 ml) en un ángulo costal dirigido hacia el corazón. Para confirmar que la aguja está dentro del corazón, retire ligeramente el émbolo y compruebe si la sangre se retira en la jeringa. Exsanguinate 0.8 - 1 mL de sangre directamente del corazón.
    3. Inmediatamente transfiera la sangre a un ácido etilendiaminotetra acético (EDTA) (1,8 mg / mL de sangre) que contenga el tubo de extracción de sangre y mezcle suavemente para prevenir la coagulación de la sangre.
    4. Euthanize los ratones mediante la administración de pentobarbital (80 mg / kg) por inyección intraperitoneal.
    5. Colocar la sangre entera encima de una solución de polisacáridos y diatrizoato sódico (relación 1: 1, densidad 1,077 g / ml) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y centriFuge (450 xg, 30 min) para permitir la separación de los leucocitos y eritrocitos del plasma.
    6. Retire y deseche el sobrenadante (plasma) usando una pipeta. Transfiera cuidadosamente la capa leucocitaria (leucocitos) y los eritrocitos (capa de glóbulos rojos) en tubos nuevos y separados usando pipetas.
  3. ICG (1,5%) etiquetado de eritrocitos
    1. Lave los eritrocitos con 1x PBS para eliminar los contaminantes. Resuspender los eritrocitos en 1x PBS (1: 1) para hacer 50% de hematocrito. Alícuota de 0,5 ml de hematocrito al 50% (~ 250 μL de eritrocitos envasados) en tubos de microcentrífuga. Centrifugar los eritrocitos (750 xg, 5 min) y descartar el sobrenadante.
    2. Añadir 200 μl de 40% 1x PBS a los eritrocitos en pellets, mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 100 μL de ICG (1,5 mg / ml) a la suspensión de eritrocitos, mezclar suavemente invirtiendo el tubo e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 300 μl de 1x PBS e incubar a37 ° C en una incubadora agitadora durante 60 min.
    3. Centrifugar los eritrocitos portadores (750 xg, 3 min) y resuspender en 1 ml 1x PBS.
    4. Lavar las células ~ 3 - 5 veces con 1x PBS hasta que el sobrenadante es claro (paso 1.3.3). Después del último lavado, se decanta el sobrenadante y se añade BSA PBS al 1% (1: 1) a los eritrocitos pre-hinchados marcados para conseguir un hematocrito al 50% (1,25 x 10 8 células / ml) de eritrocitos marcados con ICG.
  4. Marcado con fluoresceína sódica (1%) de leucocitos
    1. Después de separar la capa leucocitaria de la sangre usando la centrifugación con gradiente de densidad (de la etapa 1.2.6), lavar las células una vez con 10 ml de 1x PBS por centrifugación a 450 xg durante 10 minutos para eliminar cualquier contaminante. Resuspender el sedimento en 900 μ l de 1x PBS.
    2. Añadir 100 μl de fluoresceína sódica al 10% a 900 μl de la suspensión de leucocitos e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos. Lavar las células marcadas tres veces con 10 ml de PBS 1X por centrifugiNg (450 xg, 10 min). Resuspender las células en 100 μ l 1x PBS.

2. Imágenes en vivo de células marcadas fluorescentemente

  1. Imágenes de células vivas de eritrocitos marcados con ICG
    1. Para preparar las células para inyección a través de la vena de la cola o vía retro-orbital, diluir el hematocrito al 50% de eritrocitos marcados con ICG en 10 veces y 50 veces con 1x PBS para producir células hematocrito al 5% y 1%, respectivamente.
    2. Coloque el ratón bajo la luz infrarroja (intensidad de 250 W) durante 5 minutos para permitir que la vena de la cola se dilate. Anestesiar el ratón con hidrocloruro de ketamina (50 mg / kg) e hidrocloruro de xilazina (0,5 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal (aquí, según el esquema 1, bajo las pautas de ARVO).
    3. Dilatar cada pupila de los ojos con una gota de 0,5% de tropicamida y 2,5% de clorhidrato de fenilefrina.
    4. Coloque la lente de contacto sobre un ojo para obtener imágenes. Utilice gel oftálmico como medio para la formación de imágenes y para prevenirS de la córnea. Fijar la cámara confocal de oftalmoscopia (SLO) de escaneo láser con lente de +25 dioptrías para compensar la refracción del ojo del ratón.
    5. Coloque el ratón sobre la plataforma de imágenes SLO. Asegúrese de que la córnea del ratón esté mirando hacia la cabeza óptica de la máquina SLO.
    6. Encienda el módulo de imagen. Utilizando el software del módulo de imagen asociado, haga clic en el botón "Nuevo Paciente" y agregue detalles de identificación de animales tales como número de etiqueta de orejas de ratón, fecha de nacimiento, porcentaje de colorante fluorescente y tipo de célula marcada.
      1. Posicionar el nervio óptico del animal en el centro de la pantalla de imagen mediante la maniobra del módulo de imagen. Utilizando el software del módulo de imagen asociado, haga clic en el botón "Adquirir" para tomar las imágenes de fondo del infrarrojo (IR) con la configuración de ángulo de 30 ° o 15 °. Asegúrese de que el centro de la retina, la pupila y el trayecto óptico del láser estén alineados para lograr una imagen de la mejor calidad.
        NOTA: La trayectoria óptica se alinea maniobrando el joystick para obtener la imagen más nítida y la mejor exposición de iluminación.
    7. Tome el video del fundus ICG.
      1. Encienda el filtro ICG (790 nm), ponga la cámara en modo de alta velocidad con la vista de ángulo de 30 ° o 15 ° y ajuste la intensidad ICG en 85 para todas las lecturas para la estandarización. En el panel de control, haga clic en el botón "Adquirir" para tomar el video (control de línea de base) a 8,8 / 15 fotogramas / s durante 1 minuto.
    8. Cargar 100 μL de eritrocitos marcados con ICG en una jeringa de insulina unida a una aguja de calibre 30.
      1. Para la inyección a través de la ruta de la vena de la cola, inserte el bisel de la aguja en la vena de la cola. Confirme el acceso intravenoso comprobando el flujo de reflujo de la sangre hacia la jeringa e inyectando las células marcadas en la circulación.
      2. Para la inyección a través de la vía retro-orbital, insertar la aguja adyacente al ojo en el espacio retro-orbitalmi. Confirme el acceso retro-orbital comprobando el flujo de reflujo de la sangre en la jeringa e inyectando las células marcadas en la circulación.
    9. Después de la inyección, reposicione el ratón y tome las imágenes de fondo de IR (ver paso 2.1.6.1) y vídeo usando el filtro ICG (ver paso 2.1.7.1). Las células etiquetadas en la circulación retiniana se pueden visualizar inmediatamente después de la inyección de las células.
    10. Después de adquirir los fotogramas de vídeo, extraiga las imágenes .tiff de las secuencias de vídeo seleccionando el formato .tiff al exportar el vídeo utilizando el software del módulo de visualización SLO. Guarde los archivos en la carpeta deseada.
    11. Retire la lente de contacto, colóquela sobre el otro ojo y complete la proyección de imagen como se describe en los pasos 2.1.4 a 2.1.7.
    12. Después de la imagen, coloque el animal anestesiado bajo la luz infrarroja (250W) para mantener la temperatura corporal hasta que se recupere de la anestesia. Cuando el animal está completamente recuperado, coloque el ratón de nuevo en la jaula de espera.
  2. Imágenes de células vivas de leucocitos marcados con fluoresceína sódica al 1%
    1. Prepare el ratón y configure el instrumento como se describe en la sección 2.1.
    2. Coloque el ratón y tome las imágenes de fondo de IR como se describe en los pasos 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Obtener el angiograma de fluoresceína del ratón utilizando el filtro de fluoresceína (488 nm) con el modo de cámara de alta velocidad con la vista de ángulo de 30 ° o 15 ° y la intensidad de fluoresceína a 85 para todas las lecturas para la normalización. Grabe el video (control de línea de base) a 8,8 / 15 cuadros / s (ver paso 2.1.7.1).
        NOTA: Aquí, se han adquirido varias pistas de vídeos (vídeos de 1 minuto) en diferentes intervalos de tiempo.
    3. Inyectar 100 μL de leucocitos marcados en el ratón a través de la vena de la cola o inyección retroorbital como se describe en la sección 2.1.8.
    4. Inmediatamente después de la inyección, coloque el ratón y tome las imágenes de fondo de IR (véanse los pasos 2.1.5 y 2.1.6) y el fluoRescein del ratón (ver sección 2.2.2).
    5. Observe las células marcadas en la retina o en los vasos sanguíneos coroideos ajustando el punto focal del láser de exploración girando la perilla de enfoque del módulo de imagen.
    6. Adquiera los marcos de vídeo y las imágenes utilizando el software del módulo de visualización SLO (consulte el paso 2.1.10) y guárdelo en la carpeta deseada.
    7. Después del procedimiento, siga el paso 2.1.12 para el cuidado de los animales.
  3. Análisis de imágenes por el software MtrackJ
    1. Abra la secuencia de imágenes en ImageJ haciendo clic en "Archivo". Seleccione "Importar" y elija "Secuencia de imagen", seleccione la carpeta de imagen deseada y haga clic en "Abrir". Aparecerá una ventana emergente llamada "Opciones de secuencia" en la pantalla. Haga clic en Aceptar"; Se abrirá la secuencia de imágenes.
    2. Establezca el intervalo de trama del video de la imagen haciendo clic en "Imagen" y seleccione "Propiedades" para las mediciones de velocidad. Aquí, es 8,8 framEs / s.
    3. Abra el complemento MTrackJ seleccionando "Plugins". Seleccione "Seguimiento" y luego seleccione "MtrackJ". Deberá aparecer un menú.
    4. Para ajustar la configuración de seguimiento, seleccione "Seguimiento" (en el menú) y marque la casilla "Mover al siguiente índice de tiempo después de añadir el punto".
    5. Seguimiento de la primera celda.
      1. Localice una celda y rastree la misma celda en los marcos siguientes. En el menú haga clic en "Agregar" para agregar una nueva pista.
      2. Coloque el cursor sobre la imagen (signo +) y haga clic en la celda apropiada.
        NOTA: MTrackJ saltará automáticamente al siguiente marco de tiempo y agregará un pequeño círculo, marcando la posición del primer punto de la trayectoria.
      3. Continúe haciendo clic en la posición actual de la celda mientras se mueve a través de los fotogramas de la secuencia de imágenes.
        NOTA: Ocasionalmente, los círculos que marcan los puntos anteriores en la trayectoria interfieren con la capacidad de ver la ubicación actual. Si esto ocurre,Continúe con el paso 2.3.5.3.1.
        1. Cambie la opción de visualización de la trayectoria haciendo clic en "Visualizar" en el menú y seleccionando la opción "mostrar sólo puntos de seguimiento en la hora actual". Para ver todas las trayectorias, desactive esta opción.
      4. Continúe haciendo clic hasta que aparezca la trayectoria de la primera celda. A continuación, guarde la pista haciendo clic en "Guardar".
    6. Seguimiento de la segunda celda.
      1. En el menú, haga clic en "Agregar" para iniciar una nueva pista. Repita los pasos 2.3.5.1 - 2.3.5.4 para el seguimiento de la nueva celda. Haga clic en "Guardar" para guardar la segunda pista.
      2. Continúe estos pasos para todas las células rastreables observadas. Después de rastrear las celdas, haga clic en "Medir" y "Aceptar" en la pestaña de menú para obtener los resultados.
        NOTA: Se abre automáticamente una ventana de resultados, que se puede guardar y abrir en una hoja de cálculo para un análisis posterior.

Resultados

Los eritrocitos marcados con ICG al 1,5% se visualizaron en la circulación retiniana de ratones C57BL / 6J (tipo salvaje). Tanto el 1% como el 5% de hematocrito de 1,5% de eritrocitos marcados con ICG se distinguían en la circulación retiniana. Sin embargo, las células marcadas individuales se visualizaron más claramente con 1% de hematocrito de 1,5% de eritrocitos marcados con ICG ( Figura 1 ). En el 5% de hematocrito, debido al gran número de célula...

Discusión

El estudio de la hemodinámica en la retina y la circulación coroidea es vital para la comprensión de la fisiopatología de muchas enfermedades oculares. La dinámica del flujo sanguíneo en la circulación de la retina puede ser estudiada por tomografía de coherencia óptica de dominio de Fourier (FD-OCT), láser speckle flowgraphy (LSFG) y oximetría de retina. Aunque estos métodos utilizan diferentes enfoques para estudiar el flujo sanguíneo total en la circulación retiniana, comparten la limitación de la inca...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar. Ningún conflicto financiero o de interés.

Agradecimientos

El proyecto de investigación fue financiado bajo la beca New Investigator del National Medical Research Council (NMRC), Singapur. El equipo querrá agradecer el entrenamiento de investigación proporcionado al Dr. Agrawal en el Instituto de Oftalmología (IoO), University College London (UCL) bajo el Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC) Overseas Research Training Fellowship de noviembre de 2012 hasta octubre de 2014 bajo la tutoría del Prof. David Shima. El Dr. Agrawal adquirió el concepto y las habilidades para etiquetar las células y las imágenes en vivo en el laboratorio del Dr. Shima. Por lo tanto, el equipo agradecerá la supervisión y orientación durante la beca de formación del Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, el Dr. Peter Lundh y el Dr. Daiju Iwata.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green)Sigma Aldrich12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mLNovartisU1705A/H-1330292
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade1st BASEBUF-2040-10X1L
Bovine serum albuminSigma AldrichA7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of bloodBD, USAREF 365974
Histopaque 1077 solutionSigma Aldrich10771
Centrifuge 5810 REppendorf05-413-401
Microcentrifuge tubes 2mLAxygenMCT-200-C-S
Vortex mixerInsta BioAnalytik pte. ltdFINE VORTEX
Shaker incubatorLab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL)CevaKETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml)Troy Laboratories PTY. LimitedLI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)Alcon Laboratories, Inc. USANDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%)Alcon Laboratories, Inc. USANDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1cc/mL TuberculinTerumo (Philippenes) Corporation, PhilippinesSS-01T2613
Vidisic Gel 10GDr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabsAssure medical disposables7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2)Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscopeZEISSModel: axio imager z1

Referencias

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