CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

Summary

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלת אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI), פרוטוקול המבוסס על החדרת אתרי אנזים הגבלה לתוך רצפי DNA נרדף התאוששות פלסמיד פונקציונלי. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה בעלות נמוכה עבור מיזוג גנים מקודדים חלבונים.

Abstract

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלה אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI). יתרונות CAPRRESI מכוחות רבים של שיטת ההתאוששות הפלסמידית המקורית ומציג עיכול אנזים הגבלה כדי להקל על תגובות קשירת DNA (נדרש הרכבה כימרה). עבור פרוטוקול זה, משתמשים שיבוט wildtype גנים לתוך פלסמיד זהה (pUC18 או pUC19). לאחר הבחירה סיליקו של רצף חומצות אמינו אזורים שבהם chimeras צריך להיות התאספו, משתמשים לקבל את כל רצפי DNA נרדף לקודד אותם. אד סקריפטים Perl לאפשר למשתמשים לקבוע את כל רצפי DNA נרדף. לאחר שלב זה, עוד סקריפט Perl מחפש אתרי אנזים הגבלה על כל רצפי DNA נרדף. זה ניתוח סיליקו מבוצע גם באמצעות הגן עמיד ampicillin ( ampR ) נמצא על pUC18 / 19 פלסמידים. משתמשים בעיצוב oligonucleotides בתוך אזורים נרדפים לשבש wildtype ו ampR גנים על ידי PCR. לאחר קבלתAining ו טיהור שברי דנ"א משלימים, עיכול אנזים הגבלה הושלמה. כימרה הרכבה מושגת על ידי ligating מתאים משברים דנ"א משלימים. PUC18 / 19 וקטורים נבחרים עבור CAPRRESI כי הם מציעים יתרונות טכניים, כגון גודל קטן (2,686 זוגות זוג), מספר עותק גבוה, תכונות תגובה רצף יתרון, וזמינות מסחרית. השימוש אנזימים הגבלת הרכבה כימרה מבטלת את הצורך פולימרים DNA המניבים מוצרים קהה- End. CAPRRESI היא שיטה מהירה וזולה עבור מיזוג גנים המקודדים חלבונים.

Introduction

הרכבה גנטית Chimeric כבר בשימוש נרחב בביולוגיה מולקולרית כדי להבהיר פונקציה חלבון ו / או למטרות ביוטכנולוגיות. קיימות שיטות שונות עבור גנים התכה, כגון חפיפה PCR הגברה המוצר ¹ , התאוששות פלסמיד ² , רקומבינציה הומולוגיים ³ , CRISPR-Cas9 מערכות ⁴ , מכוונת רקומבינציה ⁵ , ו Gibson הרכבה ⁶ . כל אחד מהם מציע יתרונות טכניים שונים; לדוגמה, את הגמישות של עיצוב PCR חופפים, את הבחירה vivo של קונסטרוקציות במהלך התאוששות פלסמיד, או היעילות הגבוהה של מערכות CRISPR-Cas9 ו גיבסון. מצד שני, כמה קשיים יכולים להתעורר בעת ביצוע כמה שיטות אלה; לדוגמה, שתי הגישות הראשונות מסתמכות על שברי דנ"א קהים, ו קשירה של סוגים אלה של מוצרים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית לעומת sticKy- הסתיים קשירת. ריאקומבינציה מכוונת אתר יכולה להשאיר עקבות של רצפי DNA נוספים (scars) על המקור, כמו במערכת CreloxP ⁵ . CRISPR-Cas9 יכול לפעמים לשנות אזורי גנום אחרים בנוסף לאתר היעד ⁴ .

כאן, אנו מציגים את ההרכבה של כימאים על ידי התאוששות פלסמידית והגבלת כניסה לאנזימים באתר (CAPRRESI), פרוטוקול להרכבת גנים המקודדים חלבונים המשלבים את שיטת ההתאוששות הפלסמידית (PRM) עם החדרת אתרי אנזים מגבילים על רצפי DNA נרדפים, . כדי להבטיח שלמות חומצות אמינו רצף, אתרי אנזים הגבלה מוכנסים על רצף דנ"א נרדף מתיחה. בין היתרונות של CAPPRESI ניתן לעשות זאת באמצעות ריאגנטים רגילים של מעבדה / כלים ( למשל , אנזימים, תאים מוסמכים, פתרונות, ו thermocycler) וכי הוא יכול לתת תוצאות מהירות (כאשר האנזימים המתאימים משמשים). הסתמכות על הגבלהאתרי האנזים המגיעים מרצפי DNA נרדפים יכולים להגביל את הבחירה של נקודות ההיתוך המדויקות בתוך החלבונים המעניינים. במקרים כאלה, גנים היעד צריך להיות התמזגו באמצעות oligonucleotides חופפים, אתרי הגבלת אנזים צריך להיות מוכנס אל הגן ההתנגדות של וקטור.

CAPRRESI מורכב שבעה שלבים פשוטים ( איור 1 ): 1) הבחירה של וקטור שיבוט, pUC18 או pUC19 ⁶ ; 2) בניתוח סיליקו של sequtyences wildtype להיות התמזגו; 3) בחירה של אזורים שבירת הרכבה כימרה ו הפרעה פלסמיד; 4) בדור סיליקו של רצפי דנ"א נרדפים המכילים אתרי אנזים מגבילים; 5) שיבוט עצמאי של הגנים wildtype לתוך הפלסמיד הנבחר; 6) הפרעה פלסמיד ידי PCR, ואחריו הגבלת אנזים אכול; ו 7) התאוששות פלסמיד באמצעות קשירת דנ"א שינוי בקטריאלי. גנים Chimeric המיוצרים על ידי טכניקה זו צריך להיות מאומת wIth רצף.

PUC18 / 19 וקטורים מציעים יתרונות טכניים עבור שיבוט ו כימרה הרכבה, כגון גודל קטן ( כלומר, 2,686 זוגות זוג), מספר עותק גבוה, תכונות תגובה רצף יתרון, וזמינות מסחרית ⁷ . כאן, המארח Escherichia coli שימש כדי להרכיב ולטפל chimeras כי תרבויות חיידקים זולים לגדול מהר. בהתחשב בכך, שיבוט הבאים של שברי היתוך לתוך פלסמידים היעד הסופי יהיה צורך ( למשל, וקטורים ביטוי כמו pRK415 בחיידקים או pCMV בתאי יונקים).

CAPRRESI נבדק עבור מיזוג שני גנים עיקריים גורם sigma: E. colirpoD ו Rhizobium etlisigA . גורמי סיגמא ראשוניים הם יחידות RNA פולימראז האחראיות ליזום שעתוק, והם מורכבים מארבעה תחומים ( כלומר , σ1, σ2, σ3 ו- σ4) ⁸ . רצף חומצות האמינו lengtH של חלבונים המקודדים על ידי rpoD ו sigA הם 613 ו 685, בהתאמה. RpoD ו SigA לשתף 48% זהות (98% כיסוי). גורמי הסיגמא העיקריים הללו נחלקו לשני חלקים משלימים בין אזורים σ2 ו- σ3. שני גנים chimeric התאספו על פי עיצוב זה: כימרה 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) ו chimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). מוצרים היתוך דנ"א אומתו על ידי רצף.

Protocol

1. פרוטוקול CAPRRESI

הערה: איור 1 מייצג את פרוטוקול CAPRRESI הכולל. טכניקה זו מבוססת על עיצוב סיליקון הבנייה הבאים של chimeras הרצוי.

1. בחירה של שיבוט פלסמיד, pUC18 או pUC19.
   1. בחר את וקטור pUC המתאים ביותר דרישות טכניות.
      הערה: לשני הווקטורים יש אותו רצף, למעט הכיוון של אתר השיבוט הרב. זה חשוב עבור העיצוב של oligonucleotides ואת הפרעת פלסמיד PCR.
2. בניתוח סיליקו של גנים wildtype ו pUC18 / 19 sequences.
   1. השג את רצפי הדנ"א של הגנים wildtype ושמור אותם בקובץ פורמט FASTA ( לדוגמה, genes.fas).
      הערה: רצפים של pUC18 / 19 וקטורים הכלולים בקובץ pUC.fas ( איור 1 , שלב 1).
   2. לקבוע איזו הגבלה אנזYmes לא לחתוך את הגנים wildtype ו pUC18 / 19 sequences על ידי הפעלת סקריפט REsearch.pl. לחלופין, לבצע הגבלת אנזים חיפוש באתר עם כלי מקוון ( איור 1 , שלב 2).
      1. הקלד את הפרטים הבאים במסוף:
         פרל research.pl genes.fas
         פרל
         הערה: פקודות אלה תיצור את קבצי הפלט הבאים: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas ו- pUC_re.fas.
      2. בחר את אנזימי ההגבלה המתאימים לשיבוט הגנים wildtype לתוך האתר שיבוט מרובים של הנבחר pUC18 / 19 וקטור על ידי השוואת genes_re.fas ו pUC.fas קבצים. בחר את הכיוון של הכנס ביחס לגן עמיד ampicillin ( ampR ) של וקטור pUC18 / 19.
   3. עיצוב קדימה oligonucleotides הפוך כדי להגביר את אזור קידוד של גנים wildtype (oligonucleotides חיצוני). כלול את הגנתי הנכון אנזים באתר בכל קצה 5 'של אוליגונוקליוטידים; זה יגדיר את הכיוון להוסיף.
      1. כלול אתר פונקציונלי ריבוזום מחייב oligonucleotides קדימה.
      2. הכנס את שני גנים wildtype באותו כיוון בתוך וקטור.
3. בחירה של אזורי שבירה עבור הרכבה כימרה ו הפרעה פלסמיד.
   1. השג את רצף חומצות האמינו של wildtype ואת הגנים ampR על ידי הפעלת scriptate.pl script ( איור 1 , שלב 3).
      1. הקלד את הפרטים הבאים במסוף:
         פרל translate.pl genes.fas
         פרל translate.pl ampR.fas
         הערה: סקריפט זה ייצור את קבצי הפלט הבאים: genes_aa.fas ו- ampR_aa.fas.
   2. גלובלי ליישר את שני wildtype רצפי חומצות אמינו עם תוכנה מתאימה ( למשל, MUSCLE) ⁹ .
   3. בחר את אזורי הפסקה הרצוי (3-6 חומצות אמינו) עבור כימרה כימיתMbly מבוסס על יישור רצף. שמור אותם בקובץ בפורמט FASTA ( למשל , אזורים.).
   4. אתר את רצפי ה- DNA כי הקוד עבור חומצת האמינו שנבחרה משתרע על שני גנים wildtype.
4. בדור סיליקו של רצפי דנ"א נרדפים המכילים אתרי אנזים מגבילים.
   1. השג את כל רצפי דנ"א נרדף כי קוד עבור כל רצף חומצת אמינו שנבחרו אזורי שבירת ( איור 1 , שלב 4); רצפים אלה נשמרו בקובץ region.fas.
      1. הקלד את הפרטים הבאים במסוף:
         פרל synonym.pl region.fas
         הערה: סקריפט זה ייצור את קובץ הפלט region_syn.fas.
   2. חפש אתרי הגבלת אנזים שנמצאו על רצפי DNA נרדפים.
      1. הקלד את הבא לתוך מסוף:
         הערה: סקריפט זה ייצור את קובץ הפלט region_syn-re.fas.
   3. בחר אנזים הגבלה אחת משותפת בין רצפים נרדפים של שני גנים wildtype; אתר זה ישמש להרכבת כימורות באמצעות עיכול אנזים הגבלה. ודא כי אנזים הגבלה הנבחר לא לחתוך את הגנים wildtype ולא רצפים וקטור pUC18 / 19.
      1. השווה את אנזימי ההגבלה שנמצאו על genes_re.fas, pUC_re.fas, ו- region_syn-re.fas קבצים.
   4. ב סיליקו תחליף את המקור עבור רצפי DNA שלהם נרדף ב loci המקביל על שני גנים wildtype. צרף רצפי DNA נרדפים לקובץ הרצף wildtype (genes.fas).
   5. קבל את רצף חומצות האמינו של הגנים הכלולים בקובץ genes.fas ( genl.fas perl translate.pl ).
   6. ישר את רצפי חומצות האמינו מתורגמים מ wildtype ו sequences DNA נרדף. ודא ששני הרצפים זהים.
   7. חזור על כל השלבים של סעיף זה עם הגן ampR הנוכחי על puC18 / 19 וקטור.
      הערה: המטרה היא לשבש את הגן ampR (קובץ ampR.fas) לשני חלקים משלימים. אנזים הגבלה שנבחרה כדי לשבש את הגן ampR צריך להיות שונה מזה המשמש הרכבה כימרה.
5. שיבוט עצמאי של שני גנים wildtype לתוך הנבחר pUC18 / 19 וקטור (איור 1, שלב 3).
   1. לטהר את הדנ"א pUC18 / 19 פלסמיד נבחר באמצעות ערכת טיהור DNA פלסמיד.
      1. לדוגמה, להפוך E. coli DH5α עם pUC18 פלסמיד ולגדול את transformants לילה ב 37 מעלות צלזיוס על מוצק LB-0.3 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין (Amp). בחר מושבה המרה, לחסן חדש LB-0.3 מ"ג / מ"ל ​​צלחת Amp, ולגדול אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
      2. לקחת חלק בתרבות הקודמת לגדל אותו LB נוזלי 0.3 מ"ג / מ"ל ​​אמפר עבור 6-8 שעות ב 37 ° C. חלץ את ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת.
   2. PCR להגביר גנים wildtype מן הדנ"א הגנומי הכולל באמצעות appropOligonucleotides חיצוני להונות - -. השתמש פולימרז DNA באיכות גבוהה אם אפשר. בחר את הפולימרז DNA אשר ממקסם את התשואה. בצע PCR על פי הנחיות היצרן ואת טמפרטורת ההיתוך של oligonucleotides.
      1. הפעל מחזורי PCR, בהתאם פולימראז DNA, גודל amplicon, תבנית, ו oligonucleotides בשימוש. לדוגמה, כדי להגביר את ה- DNA RPOD , להכין תגובה 50 μL: 5 μL של חיץ 10x, 2 μL של 50 מ"מ MgSO ₄ , 1 μL של 10 mM dNTP לערבב, 2 μL של כל oligonucleotide 10 מיקרומטר (טבלה 2), 2 ΜL של ה- DNA תבנית ( E. קולי DH5α סך DHNA), 35.8 μL של מים טהור במיוחד, 0.2 μL של פולימרז DNA גבוהה נאמנות. הפעל את מחזורי ה- PCR הבאים: 1 דקות ב 94 מעלות צלזיוס עבור denaturation הראשונית ואחריו 30 מחזורים של הגברה (30 s ב 94 מעלות צלזיוס כדי להכחיש, 30 s ב 60 מעלות צלזיוס כדי anneal oligonucleotides, ו 2 דקות ב 68 מעלות צלזיוס להרחיב).
      2. ממיסים 1.2 גרם שלAgarose ב 100 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים על ידי חימום אותם במיקרוגל. להרכיב מגש ג'ל מסרק ולשים אותם גלגלית ג'ל אופקי. ממלאים את מגש ג'ל עם פתרון agarose מומס ולתת לו לחזק. הסר את המסרק.
      3. מניחים את הג'ל לתוך תא אלקטרופורזה. מילוי קאמרית עם חיץ 1x Tris-acetate-EDTA. טען 50 μL של מוצרי PCR לתוך בארות ג'ל. Electrophorese דגימות ( למשל , ב 110 V עבור 1 שעות).
      4. לאחר אלקטרופורזה, הכתם ג 'ל ב 100 מ"ל של מים מזוקקים המכילים 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל ​​ethidium פתרון ברומיד במשך 10 דקות עם רעד איטי. לשטוף את הג'ל במים מזוקקים במשך עוד 10 דקות בהילוך איטי; השתמש שייקר אופקי.
         זהירות: ethidium bromide הוא תרכובת רעילה; ללבוש כפפות מגן ומעיל כותנה.
      5. לטהר DNA wildpepe הגן מן הלהקות המקביל של ג'ל באמצעות ערכת. לדמיין את להקות ידי הצבת ג'ל מוכתם בתא UV (אורך גל מומלץ: 300 ננומטר). שמור על החשיפה של הג'ל למינימום. השתמש ערכת טיהור DNA ופעל לפי הוראות היצרן.
         זהירות: קרינת UV מסוכנת; ללבוש מגן מגן, משקפיים ומעיל כותנה.
   3. תקציר גנים מטוהרים wildtype ו pUC18 / 19 DNA פלסמיד עם אנזימים הגבלה על פי הוראות היצרן. השתמש אנזימים עיכול מהיר כאשר אפשרי. לדוגמה, לעכל 6 μL של DNA pUC18 (300 ng / μL) ב 10 μL של מים ultrapure, 2 μL של חיץ 10X, 1 μL של אנזים KPn אני הגבלה, ו 1 μL של אנזים אני מגביל I. השאירו את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      1. להשבית את אנזימי הגבלה על פי הנחיות היצרן. לדוגמה, לבטל את התגובה העיכול פעמיים Kpn אני- XBA אני ב 80 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
   4. מערבבים להוסיף: DNA וקטור ב rati volumetricO של 3: 1. בצע את הוראות היצרן עבור התגובה קשירת. השתמש אנזימים קשירת מהיר כאשר אפשרי (להשאיר את התגובה ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות).
      הערה: בדרך כלל, ריכוז ה- DNA לאחר טיהור באמצעות ערכות טוב מספיק עבור עיכול התגובות קשירת. לדוגמה, להוסיף 6 μL של דנ"א rpoD ( Kpn אני- XBA אני, 150 ng / μL), 3 μL של DNA pUC18 ( Kpn אני- XBA אני, 150 ng / μL), 10 μL של חיץ 2x, 1 μL של ultrapure מים, ו 1 μL של ליגז DNA T4. השאירו תגובה קשירת ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   5. להפוך את E. coli DH5α עם μL 2-4 של התגובה קשירת, כמתואר בחומרים משלימים. פלייט התאים הופכים ללוחות מוצקים LB / Amp / X-gal / IPTG. השאירו את הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
   6. בחר בצבע לבן מושבות E. coli מושבות להכות אותם על צלחת LB / Amp חדש. השאירו את הצלחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס/ Li>
   7. בצע המושבה PCR לבחור מועמדים עבור רצף התגובה, כמתואר בחומרים משלימים. חלץ DNA פלסמיד מן המועמדים. לחלופין, לעכל DNA פלסמיד מועמד עם אנזימים הגבלה אותו משמש שיבוט מוסיף.
   8. רצף מועמדים קונסטרוקציות עם ספק שירות רצף ¹⁰ . להרכיב את רצף סיליקו באמצעות אסמבלר DNA ¹¹ ( איור 1 , שלב 5).
6. פלסמיד הפרעה על ידי PCR ואחריו הגבלת אנזים אכול.
   1. עיצוב סיליקון קדימה ואוליגונוקליוטידים הפוכה באזורים הפסקה עבור wildtype ו ampR גנים, בהתאמה. תחליף סיליקו קטע wildtype עבור רצף DNA המקביל שלו המקביל (שהושג בשלב 1.4).
      הערה: רצף DNA זה נרדף מכיל אנזים הגבלת האתר. קדימה ואוליגנוקליוטידים הפוכה חפיפה ב tהוא הגבלת אנזים האתר. Oligonucleotides צריך לנוע בין 21-27 נוקלאוטידים, בסופו של דבר עם ציטוזין או גואנין, ומכילים אתר אנזים הגבלה. אולגונוקליוטידים קדימה יש את אותו רצף כמו אזור היעד שלה על ה- DNA תבנית. A olononucleotide הפוך הוא רצף משלים לאחור של אזור היעד על ה- DNA תבנית.
   2. השתמש בשני מבני הגן wildtype כמו תבנית ה- DNA עבור תגובות PCR ( למשל, pUC18 rpoD ו pUC18 sigA ). השג שני חלקים משלימים של כל בנייה (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 siga σ1-σ2, ו pUC18 siga σ3-σ4) ( איור 1 , שלב 6).
   3. טען דגימות DNA לתוך ג'ל agarose 1-1.2% [w / v]. להפריד את מוצרי ה- PCR מתבנית ה- DNA על ידי אלקטרופורזה ( למשל, 110 V עבור 1 שעות). לחלופין, לעכל את תגובות ה- PCR עם Dnn אני לשבור את תבנית ה- DNA.
      הערה: Dpnאנזים מזהה רק רצפי דנ"א מתילתיים (5'-GATC-3).
      1. לטהר את דגימות באמצעות ערכת טיהור DNA. בצע את ההנחיות של היצרן.
   4. עיכול כפול כל שברי דנ"א משלימים עם אנזימים הגבלה המתאימה על פי הוראות היצרן. השתמש אנזימים הגבלת מהיר לעכל כאשר אפשרי. לדוגמה, פעמיים לעכל את קטע pUC18rpoDσ1-σ2 DNA עם Afl II ו Spe אני משתמש בפרוטוקול של היצרן. השאירו את התגובה העיכול ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   5. להשבית את אנזימי הגבלה על פי הנחיות היצרן. לדוגמה, להשבית Afl II- אני מדבר על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
7. פלסמיד התאוששות באמצעות קשירת דנ"א שינוי בקטריאלי.
   1. מערבבים את שברי דנ"א תקין ביחס 1: 1 volumetric להרכיב את הגן chimeric הרצוי ( איור1, שלב 7).
      הערה: בדרך זו, שלמות הגן ampR משוחזר, לייצר חלבון פונקציונלי.
      1. לדוגמה, לערבב 4 μL של pUC18 rpoD σ1-σ2 דנה (מתעכל עם אפל II- אני מדבר , 150 ng / μL), 4 μL של pUC18 sigA σ3-σ4 דנ"א (אפל II- אני, 150 ng / μL) 10 μL של חיץ 2x, 2 μL של מים ultrapure, ו 1 μL של ליגז DNA T4; ריכוז ה- DNA לאחר טיהור ערכת הוא טוב מספיק לעיכול קשירת הבאים. השאירו את התגובה קשירת על 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   2. המרה E. DH5α coli עם μL 3-5 של התגובה כימה הרכבה קשירת (חומרים משלימים). לגדל את התאים המרה ב LB / Amp / X-gal / צלחות IPTG לילה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   3. בחר בצבע לבן מושבות E. coli מושבות להכות אותם על צלחת LB / Amp חדש. השאירו את הצלחות בן 37 ​​בלילה° C.
   4. בצע המושבה PCR לבחור מועמדים לתגובה רצף, כמתואר בחומרים משלימים. דמיינו להקות ב 1-1.2% (w / v) ג'ל agarose ידי ביצוע electrophoresis (המתואר בשלב 2.3.2.1).
   5. לגדל תרבויות ממועמדים חיוביים. חלץ DNA פלסמיד מהם באמצעות ערכת טיהור DNA פלסמיד.

2. רצף המועמד Chimeric קונסטרוקציות

1. ודא את האיכות של ה- DNA פלסמיד הוא מספיק טוב עבור התגובה רצף על ידי ההנחיות הבאות מתוך ספק השירות רצף. חלץ DNA באמצעות ערכות טיהור. לדוגמה, בדף האינטרנט של ספק השירות רצף, להקדיש תשומת לב מיוחדת ריכוז ה- DNA המומלץ עבור דגימות. השג את הריכוז של דגימות באמצעות מכשיר כימות DNA.
2. רצף מועמד chimeric קונסטרוקציות עם ספק שירות רצף ¹⁰ .
3. להרכיב se Quencing קורא עם אסמבלר דנ"א סיליקון ¹¹ .
4. ליישר התאספו לעומת ברצפים chimeric סיליקון מעוצב באמצעות רצף יישור כלים ^{9 , 12} . ודא כי הגן chimeric היה התמזגו בהצלחה.

3. הכנת ההכנות

הערה: כל השלבים מעורבים תאים חיים צריך להתבצע מכסה המנוע זרימה למינרית נקי עם מבער Bunsen ב.

1. הפקת E. coli DH5α תאים מוכשרים.
   1. כדי לייצר תאים coli -competent, בצע פרוטוקולים שפורסמו ¹³ או לראות את החומרים המשלימים . לחלופין, להשתמש בתאים המוסמכים זמין מסחרית.
2. טרנספורמציה E. coli DH5α תאים מוכשרים.
   1. עבור השינוי הכימי של תרבויות E. coli , בצע פרוטוקולים שפורסמוClass = "xref"> 13 או לראות את החומרים המשלימים . לחלופין, להשתמש electroporation עבור שינוי חיידקי. אם נעשה שימוש בתאים מסחריים זמינים, פעל לפי הנחיות היצרן.
3. טיהור דנ"א גנומי ופלסמיד מ E. coli DH5α.
   1. ביצוע מיצוי חומצות גרעין, כאמור בחומרים משלימים , באמצעות ערכות זמינים מסחרית או בעקבות פרוטוקולים שפורסמו ¹³ .
4. בצע המושבה PCR.
   1. השתמש בטכניקה זו כדי לזהות מועמד מושבות טרנספורמציה לתגובה רצף הבאים.
      הערה: שיטה זו אינה מייצגת אימות סופי של שלמות הרצפים. תיאור מפורט של טכניקה זו זמין חומרים משלימים .
5. הכנת הפתרונות.
   1. לִרְאוֹת טבלה 1 לקבלת מידע נוסף על הכנת פתרונות.
6. הורד את הסקריפטים ואת קבצי הרצף הדרושים לפרוטוקול CAPRRESI.
   1. הורדת קבצים בנק גן המכיל את רצף הגנום המלא של המינים הרצוי, לחלץ את רצף ה- DNA של הגן שנבחר באמצעות דפדפן הגנום, ולשמור אותו בפורמט קובץ fasta. הורד את התסריטים של Perl הדרושים לפרוטוקול CAPRRESI. אחסן את הסקריפטים ואת קבצי הרצף באותה ספריה.

תוצאות

איור 1 מתאר את CAPRRESI. באמצעות שיטה זו, שני גנים chimeric התאספו על ידי החלפת תחומים של שני גורמי סיגמא עיקרי חיידקי ( כלומר, E. coli RpoD ו R. etli SigA). רצפי ה- DNA של גנים rpoD ו sigA התקבלו באמצעות דפדפן Genome Genem ¹⁴ מ GenBank קבצים הגנום N...

Discussion

CAPRRESI תוכנן כחלופה ל- PRM ² . PRM המקורי הוא טכניקה חזקה; זה מאפשר את היתוך של רצפי DNA לאורך כל חלק של הגנים שנבחרו. עבור PRM, גנים wildtype צריך להיות משובטים לאותו פלסמיד. לאחר מכן, oligonucleotides נועדו בתוך wildtype ואנטיביוטיקה גנים ההתנגדות נמצא על הפלסמיד. שיבוש פלסמיד מוש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity	Thermo Fisher	11304011	Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products
High pure plasmid isolation kit	Roche	11754785001	Used for all plasmid purification reactions
High pure PCR product purification kit	Roche	11732676001	Used for all PCR purification reactions from agarose gels
AflII restriction enzyme	New England Biolabs	R0520L	Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C
KpnI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3142L	Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C
SpeI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3133L	Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C
XbaI restriction enzyme	New England Biolabs	R0145L	Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A0166-5G	Antibiotics
Nalidixic acid	Sigma Aldrich	N8878-5G	Antibiotics
Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y1625-1KG	Bacterial cell culture
Casein peptone	Sigma Aldrich	70171-500G	Bacterial cell culture
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG	Sodium chloride
Agar	Sigma Aldrich	05040-1KG	Bacterial cell culture
XbaI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0684	Fast digest XbaI enzyme
KpnI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0524	Fast digest KpnI enzyme
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200S	Fast DNA ligation kit
AflII restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0834	Fast digest AflII enzyme
SpeI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD1253	Fast digest SpeI enzyme