Os autores gostaria de agradecer o apoio do laboratório de pesquisa de exército dos Estados Unidos (ARL) Postdoctoral Fellowship programa, administrado pela Oak Ridge Associated universidades através de um contrato com ARL, através da nomeação do Dr. Justin P. Jahnke. Restante de financiamento foi fornecido por sensores e direcção de dispositivos de elétrons no ARL. Os autores também gostaria de agradecer ao laboratório Daugherty na UCSB a biblioteca exibir bacteriana e informações para clonagem o reagente YPet Mona, Dr. Bryn Adams para apoio na clonagem o reagente YPet Mona no ARL, Dr. Joshua Kogot pelo seu trabalho inicial na e treinamento em biopanning de bacteriano exibir bibliotecas, Alena calma de Edgewood químicas e biológicas centro de partilha de plasmídeos usados para expressar e purificar abrax e proteínas rivax, Brandi Dorsey para obter suporte técnico para o isolamento de peptídeos de vinculação de PA, Qin Guo para suporte técnico de experimentos preliminares para isolamento de peptídeos de ligação abrax e Dr. Jessica Terrell em discussões úteis sobre este manuscrito.

Os autores não têm nada a divulgar

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas tem sido uma abordagem bem-sucedida para o isolamento dos reagentes de afinidade, e peptídeos oferecem uma alternativa útil para anticorpos para reconhecimento quando critérios específicos são necessários, tais como a estabilidade em ambientes extremos. Foi racionalizado Biopanning dessas bibliotecas usando os autoMCS métodos descritos aqui, e uma plataforma de autoMCS disponíveis comercialmente esta tecnologia estende-se a uma audiência muito mais ampla. Em comparação com a tradicional alternância MCS/FACS métodos de triagem para bacteriano exibem bibliotecas, autoMCS métodos são menos caros, porque eles não exigem investimento em um instrumento mais caro de FACS capaz de classificar e isolar as células acopladas, em vez do tipo de citômetro de fluxo que é usado aqui, que só é capaz de análise 14. Os passos críticos para sucesso biopanning por autoMCS incluem a seleção de programa de separação, negativa de classificação contra Cruz-reagentes potenciais para reduzir falsos positivos, enriquecimento de biblioteca usando FACS para determinar quando parar biopanning, de monitoramento e análise inteligente da piscina para evitar incómoda triagem de centenas de candidatos candidato.
Os exemplos aqui descritos demonstram biopanning bem-sucedida da biblioteca exibir bacteriana escolhido para dois alvos distintos, PA e abrax, embora com estratégias de análise ligeiramente diferente devido a diferenças nas sequências peptídicas para cada pool de candidatos após quatro rodadas de biopanning. PA foi o caso mais simples, com análise de sequência demonstrando tendências claras das sequências peptídicas que repetido pelo menos uma vez em 144 colônias. Isto sozinho foi suficiente para determinar uma sequência de consenso para o alvo de PA e as colônias que continha o consenso ou uma sequência semelhante foram os melhores candidatos em termos de relação de vinculação para PA versus vinculação ao controle negativo estreptavidina. No entanto, isto não será sempre o caso. Para o destino de abrax, 100 colônias sequenciamento levaram a cinco sequências de repetição, mas a tendência nessas sequências foi menos clara, que não seja uma tendência conterem resíduos de aminoácidos aromáticos e ácido aspártico e asparagina. O "consenso" predito de sequências de repetição só poderia produzido e testado pela afinidade para abrax, mas como nenhum sequências de pai continham essa sequência consenso exato, voltamos à lista de colônias sequenciadas e observado que outros candidatos que tinha tendências mais em comum com os outros. Na verdade, duas colônias continham uma sequência semelhante ao "consenso" das sós, de repetições (FWDTWF em vez de FWAWF), que tinham a mesma tendência de resíduos de ácido aspártico, fenilalanina e triptofano, mas com espaçamento diferente. Dentre estes peptídeos foi uma sequência de repetição, um não foi. Estas duas sequências, juntamente com uma terceira sequência contendo uma variante semelhante, estavam entre os top 5 ligantes testados em termos de afinidade para abrax. O superior geral de fichário, AX-A05, também exibido tendências similares. Os resultados para abrax demonstram que uma abordagem que alterna várias vezes entre análise de sequência e análise de afinidade e especificidade às vezes será necessária, dependendo do destino escolhido. Os resultados para o destino de abrax também demonstram o nível de especificidade que pode ser alcançado por uma proteína muito semelhante (rivax 1,15).
Os programas de autoMCS selecionados para nossos estudos foram Posselds e Posseld, que são ambos para a selecção positiva das células alvo etiquetados com baixa frequência, a menos de 5% da população inicial. Em ambos os casos, as células passam por duas colunas magnéticas. No caso do programa de Posselds, no entanto, células passam mais lentamente a primeira coluna para aumentar o tempo de exposição 41. Além as descrições do programa fornecidas pelo fabricante do dispositivo autoMCS comercial (veja a Tabela dos materiais) 41, estes programas foram escolhidos após uma comparação inicial de vários programas de potenciais. Capacidade de cada programa para evitar puxar para fora de falsos positivos de uma cultura homogênea de células de controlo negativo e isolar com sucesso um fichário conhecido para um alvo de interesse de uma cultura mista, contendo células de controlo negativo cravadas com uma diminuição percentagem do fichário conhecidos, foram comparados. Se significativamente desviando as aplicações descritas aqui, uma comparação semelhante pode ser útil na seleção do programa para o novo aplicativo. No entanto, anteriormente publicados resultados comparando esses dois programas (Posseld e Posselds) para isolamento de peptídeo afinidade reagentes para PA mostrou que usar um desses programas para todas as quatro rodadas de biopanning levou ao isolamento de peptídeos com semelhante afinidade e especificidade para PA e determinação do consenso WXCFTC. As principais diferenças eram que Posseld, com sua taxa de fluxo mais rápida, resolvida mais rapidamente e vinculação afinidade para o alvo, portanto, foi maior depois de apenas duas rodadas de biopanning, enquanto usar Posselds levou a mais sequências únicas após quatro rodadas de biopanning 14. aprendendo com isso, a estratégia foi ligeiramente alterada quando biopanning para peptídeos de vinculação abrax incorporar ambos os benefícios: Posselds foi usado para o 1º Round para permitir mais tempo de exposição, durante esta etapa crítica onde diversidade é mais alta, mas depois o programa foi trocado para Posseld para mais rápido isolamento dos fichários de afinidade mais alta durante rondas 2-4 1,15. Isto parecia ser ideal para abrax, especialmente desde que o NFMI e a ligação por cento foram ambos superior para abrax classificação rodada 4 em comparação com PA 4 redondo com qualquer programa de triagem (Figura 2 e Figura 3 e Sarkes et al 2015 14), mas uma comparação direta usando a estratégia de um contra o outro com o mesmo destino seria necessária para uma comparação mais conclusiva. Qual programa é melhor para um determinado aplicativo pode depender o destino individual, biblioteca classificação usada e o nível de expressão de peptídeo que é alcançado com qualquer alteração às condições aqui descritas.
Não discutidos aqui são potenciais resultados de biopanning com materiais abióticos, mas também usamos a mesma biblioteca de exibição bacteriana por biopanning contra granel alumínio 2. Este estudo não foi realizado utilizando autoMCS, mas estudos semelhantes poderiam ser feitos usando o autoMCS, se o material está disponível, ou poderia ser revestido em ou conjugado, para uma esfera magnética. No estudo de alumínio grosso, aminoácidos individuais de análise e modelagem de estrutura secundária foi útil em compreender o que estava dirigindo a afinidade obrigatória dos peptides isolados, desde que nenhuma sequência de consenso foi determinado 2. Mesmo com alvos biológicos, podem ser necessário para entender o que está dirigindo a afinidade obrigatória para alguns destinos, é por isso que a planilha gerada a partir da macro "eCPX_Sequencing" inclui uma guia com análise de frequência de resíduos individuais. Se não há sequências de repetição são vistas além da falta de um consenso, e frequência de resíduo não mostra nenhum padrão, no entanto, outros tipos de análise podem ser necessários. Além disso, mais rodadas de classificação pode ser necessário para evitar um número muito maior de candidatos para seleção daqueles com afinidade suficiente para o destino desejado para baixo de triagem.
Com a crescente disponibilidade de sequenciamento de próxima geração, um estudo mais aprofundado poderia ser executado para determinar os candidatos mais promissores antes de testar a afinidade e para determinar o grau de enriquecimento após cada rodada de biopanning. Contudo, sequências de avançar para a etapa de análise de ligação podem precisar ser re-criado por clonagem, se eles não são de frequência alta o suficiente para isolar facilmente com sequenciamento de rotina da colônia de dezenas ou centenas de colônias. Como esta tecnologia avança, tornando-se menos caro e mais rotina, e especialmente com uma opção para isolamento de colônia, que provavelmente vai ser a melhor maneira de analisar os dados biopanning. Pode levar à elucidação das sequências de maneira individuais, e toda a biblioteca, evoluir. Além disso, as bactérias na biblioteca classificação podem sofrer mutações ao longo do tempo, que poderia influenciar a classificação para as células com mais rápido crescimento taxas ou bactérias que overexpress genômicas proteínas capazes de vincular um material mesmo sem expressão andaime e peptídeo de exibição, para instância. Por essa razão, uma vez que os candidatos promissores emergem, vale isolar o plasmídeo, retransforming fresco e. coli e confirmando a ligação peptídica através de FACS. Se planeja usar o peptídeo em um formato livre de célula, afinidade também deve ser avaliada para o peptídeo livre. Por exemplo, os reagentes de afinidade de peptídeo descobertos através de exposição bacteriana para o destino SEB foram produzidos sinteticamente fora-célula e analisados pelos métodos mais tradicionais como ensaio enzima-lig immunosorbant (ELISA) e na célula (através de FACS) e fora de células (através de ELISA) afinidade foram comparados usando o Kds determinado por ambos os métodos 7.
Embora a força da interação estreptavidina-biotina torna uma estratégia ideal para captura de proteína alvo e peptídeos ligados, este procedimento pode ser modificado para outras estratégias de captura. Acoplamento direto da proteína para grânulos magnéticos, como epóxi e grânulos de ácido carboxílico, tem sido bem sucedido e remove uma etapa de ligação. No entanto, ligação directa pode impedir potenciais sítios de ligação de forma específica ou não-específica, dependendo da estratégia de fixação. Uma vantagem adicional ao uso de grânulos de estreptavidina é que menos proteína estável alvos podem ser recém biotinilado em 30 min ou armazenados congelados, se necessário, enquanto os grânulos se tendem a exigir mais tempo incubação com a proteína para cross-linking e são geralmente armazenado a 2-8° C. A concentração inicial sugerida de biotinilado proteína alvo aqui, 600 nM, foi bem sucedido para vários destinos, mas pode ser possível isolar os reagentes de captura de peptídeo com afinidade aumentada se essa concentração é reduzida. Além disso, este método pode ser estendido para e modificado para outras bibliotecas de exibição bacteriana e outros organismos. Por exemplo, estas etapas podem ser executadas na ausência de oxigênio para uso com anaeróbios, ou em outros ambientes para uso com extremófilos para isolar peptídeos com propriedades únicas. Os peptídeos e/ou consenso determinado para um destino específico de interesse pode ser potencialmente usados na célula como a vida material, ou produzidos sinteticamente fora-célula. Peptídeos produzidos sinteticamente podem ser ainda mais amadurecidos para o desenvolvimento da afinidade ainda maior e mais robustos agentes de proteína catalisada capturar (PCC) para uso em sensores, ou para outras aplicações onde anticorpos costumam ser usados para vinculação ou reconhecimento 38,,55. Modelagem molecular pode também ser usada para ajudar a determinar a ligação local do peptide com seu alvo, como recentemente foi realizado para os peptídeos de ligação abrax e consenso listados na Figura 5 1. Em geral, bibliotecas de exibição bacteriana biopanning para reagentes de afinidade do peptídeo é uma alternativa rápida, simples e poderosa para a produção de anticorpos para o reconhecimento e detecção de alvos de proteína e esta biopanning semi-automático abordagem tem produzido resultados confiáveis com aplicações de grande envergadura.

Biopanning é uma técnica comprovada para a descoberta do reagente de afinidade, com bacteriano exibir bibliotecas uma fonte conveniente para peptídeo afinidade reagentes 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Da mesma forma para fago 25,26 e levedura exposição 27,28, os peptídeos são expostos na superfície das células e estão disponíveis para vincular a alvos bióticos e abióticos, com essas interações guiado por tanto a espinha dorsal do peptide e as propriedades únicas de cadeias laterais de aminoácidos 29. Em contraste com a exibição do fago, as bactérias se são auto-replicantes e contêm todo o material genético necessário para a exibir sem eluição do fago encadernado e reinfecção das células. Em contraste com a exibição de levedura, visor bacteriana é mais rápido devido a rápida (aproximadamente 20 min 30) tempo de Escherichia colide duplicação. Os reagentes de afinidade de peptídeo resultante podem ser produzidos fora de células para uso em uma variedade de plataformas 16,17,26 de sensoriamento e têm potencial para uso como materiais vivos quando exibido na célula- 2 , 31 , 32. em comparação com os anticorpos monoclonais para reconhecimento de metas específicas, peptídeos são muito menores e mais flexíveis, e bibliotecas de exibição de peptídeo podem ser facilmente manipuladas no nível do DNA, para evitar a aminoácidos específicos, como a cisteína 33 . Peptídeos são cada vez mais explorados para terapêutica 34,35,36 e outras aplicações onde anticorpos normalmente iria ser utilizados devido a sua facilidade de descoberta, reprodutível sintético (fora-célula ), produção e manutenção superior de desempenho em ambientes extremos, proporcionando um reagente funcional mesmo após exposição à alta temperatura ou armazenamento a longo prazo sem refrigeração 37,38. A capacidade de superar a cadeia de frio para armazenamento de reagentes é de particular interesse para o departamento de defesa, por exemplo, que deve operar em ambientes extremos. Estabilidade térmica, portanto, era uma característica desejável para os reagentes de afinidade, reconhecendo os alvos escolhidos dados como exemplos neste manuscrito.
Recentemente, biopanning bacteriana exibir bibliotecas tornou-se ainda mais simples e confiável com o uso de semi-automatizadas magnético-ativado da pilha (MACS ou MCS) métodos 9,14,39de classificação. Esses métodos foram demonstrados para alvos biológicos usando vários semelhantes plataformas com vantagens diferentes, incluindo um comercialmente disponível de classificação automatizada magnético-ativado da pilha (autoMACS ou autoMCS) instrumento de classificação (ver tabela de materiais) 1,14,15 e dispositivos mais especializados que coloque a amostra em um cartucho descartável 7,9 ou chip 39, uma valiosa especificação para usam com organismos ou toxinas que são nível de biossegurança 2 (BSL-2) ou superior7. Esses métodos semi-automático poderiam ser estendidos para classificar por peptídeos capazes de unir materiais abióticos se os materiais são magnéticos ou têm a capacidade de ser revestido em uma esfera magnética e para uso com diferentes organismos (por exemplo, bactérias anaeróbias) se a classificação e condições de crescimento são alteradas. Além de classificação bacteriana exibir bibliotecas, o instrumento de autoMCS comercial usado aqui também tem sido utilizado em parte para os passos iniciais da descoberta de fragmentos de anticorpos de cadeia única humana exibida na superfície da levedura, seguida pelo isolamento adicional usando fluorescente ativado celular classificação (FACS) 40. As principais vantagens de automação semi decrescem classificação tempo e esforço e mais robusta e reprodutível eliminação de pilhas unbound de grânulos magnéticos durante as etapas de lavagem, levando à redução de falsos positivos, menos rodadas classificação necessárias e menos análise de jusante complicado 9,14. No caso do instrumento de autoMCS comercial, existem vários programas pré-instalados que podem ser ideais para aplicações diferentes, como negativo pré-triagem (depleção), priorizando a pureza, minimizando o volume de amostra final e aumentando ou diminuindo a sensibilidade para o isolamento de células raras 41.
O foco deste trabalho é demonstrar a metodologia para biopanning uma biblioteca de exibição bacteriana usando o instrumento de autoMCS disponíveis comercialmente e para expor o processo de pensamento aplicado na análise e minimizando a piscina resultante dos candidatos em fim de facilitar a extensão para outras aplicações. A biblioteca de exibição usada aqui (veja a tabela de materiais) 12,13 contém aproximadamente 109- 1011 15-mer exclusivo peptídeos exibidos através de uma versão modificada da proteína da membrana externa bacteriana OmpX em um natureza irrestrita na superfície da célula, que é esperada para ser o representante do peptide livre em solução, se produzido sinteticamente. Este andaime de proteína, além disso, contém um peptídeo de controlo positivo P2X no C-terminal para monitoramento de expressão através da ligação a YPet Mona. No entanto, uma biblioteca comprada ou romance com diversidade adequada e outras características necessárias para o aplicativo específico desejado deve funcionar da mesma forma com este procedimento biopanning, apesar de algumas pequenas mudanças podem ser necessárias. Um esquema do presente protocolo biopanning é ilustrado na Figura 1. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para outro automatizado plataformas classificação magnéticas e outras estratégias de classificação. Classificação magnética manual com um ímã de bancada tem sido demonstrado com sucesso, embora com mais complicado e demorado a jusante análise necessária devido a aumento de falsos positivos 14e, no entanto, fornece uma opção alternativa para o autoMCS passos se nenhuma célula magnética automatizada classificação dispositivo está disponível.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para descoberta de reagente de afinidade de peptídeo para reconhecimento de alvos bióticos e abióticos. Reagentes de afinidade de peptídeo podem ser usados para aplicações semelhantes a anticorpos, incluindo detecção e terapêutica, mas são mais robustos e capazes de executar em ambientes mais extremos. Enriquecimento específico dos agentes de captura do peptide para um alvo da proteína de interesse é realçado usando métodos de triagem semi-automático que melhoram a vinculação e lavagem as etapas e, portanto, diminuem a ocorrência de falsos positivos aglomerantes. Um método de classificação semi-automático é descrito neste documento para uso com uma comercial automatizada magnético-ativado célula classificação dispositivo com um display bacteriano irrestrito classificação biblioteca expressando 15-mer aleatória de peptídeos. Com pequenas modificações, estes métodos são extensíveis a outros dispositivos, outras bibliotecas de classificação e outros organismos automatizados. Um objetivo principal deste trabalho é fornecer uma metodologia abrangente e expor o processo de pensamento aplicado na análise e minimizando a piscina resultante dos candidatos. Estas técnicas incluem análise de vinculação na célula usando fluorescência-ativado da pilha (FACS), de classificação para avaliar a afinidade e especificidade durante classificando e comparando os candidatos individuais, e a análise de peptídeo sequências para identificar tendências e sequências de consenso para compreender e melhorar potencialmente a afinidade de e especificidade para o alvo de interesse.

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Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para a descoberta dos reagentes de afinidade do peptide, uma alternativa robusta para anticorpos. O método de classificação semi-automatizadas aqui simplificou biopanning para diminuir a ocorrência de falsos positivos. Aqui ilustramos o processo de pensamento e técnicas aplicadas na avaliação de candidatos e minimizando a análise a jusante.

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

The overall goals of this bio-panning procedure are to rapidly isolate peptide capture agents to a specific protein target of interest and to quickly and effectively eliminate the nonspecific candidates from further downstream analysis. This method can be used for the discovery of robust peptide affinity reagents for a variety of applications, from the detection of biological threats to the diagnosis of disease. The main advantage of this technique is that the peptide affinity reagents can be rapidly isolated in about one week without a significant amount of training.Although this method can be used to discover peptide affinity reagents for off-cell use, the peptides could also be used as living materials. Generally, the most difficult aspect for individuals new to this method will be the downstream sequence analysis of the candidates, which interplays heavily with the experimental protocols shown here. Bio-panning bacterial display libraries is a cyclical process that begins with negative sorting against the magnetic beads themselves to remove any nonspecific binders to the bead material or any attached capture proteins.The negative fraction that does not bind the magnetic beads should be retained. Additional negative sorting can be performed against any potential cross-reactive protein targets, and the negative fraction that does not bind the magnetic beads is again retained. Subsequent positive sorting steps are very similar to negative sorting against a protein target, but this time the magnetic bead-bound positive fraction is retained.For positive sorting of the bacterial display library, first inoculate 500 milliliters of Luria Broth Miller supplemented with chloramphenicol, or LBCM-25, with approximately one times 10 to the 11th cells of a diverse bacterial display sorting library pre-depleted of undesired peptides by negative sorting. Incubate the library at 37 degrees Celsius in 225 RPM until the culture reaches an OD 600 of 0.5 to 0.55. Then induce peptide expression with 0.04%L-arabinose for 45 minutes at 37 degrees Celsius with shaking.At the end of the induction period, place the culture on ice. And collect two times ten to the 11th bacterial cells by centrifugation. Re-suspend the pellet in 1.5 milliliters of PBS with gentle swirling.And split the bacteria into multiple micro centrifuge tubes as necessary for a second centrifugation. Re-suspend the pellet in one milliliter of PBS supplemented with the biotinylation target of interest for a 45 minute incubation at four degrees Celsius on a rotating platform. In the meantime, wash 100 microliters of Streptavidin-encoded beads in one millimeter of PBS supplemented with bovine serum albumin, or BSA, by centrifugation.Placed the washed beads in a bench top magnetic particle separator and carefully remove the super nadent, taking care not to disturb the pellet. At the end of the rotating incubation, centrifuge the cells to collect any unbound target in the super nadent and re-suspend the target protein bound bacteria cell pellet in one milliliter of PBS plus BSA. Use the entire volume of bacterial cells to re-suspend the bead pellet.Incubate at four degrees Celsius on a rotating platform for 30 minutes. Then place the bead and bacteria solution on ice. Turn on the auto max instrument to initialize the system and select wash now, rinse, and run in the separation menu to prime the lines with the manufacturer's wash and run buffers respectively.At the end of the wash, prime the lines one more time using PBS plus BSA buffer. When the instrument is ready, transfer the bacteria and bead mixture into a 15 milliliter conical tube and rinse the tube with an additional 500 microliters of fresh PBS plus BSA. Pull the wash with the bacteria and bead mixture and place the tube into the sample slot of a four degrees Celsius conical tube rack.Place empty 15 milliliter collection tubes into the positive and negative selection slots of the rack and transfer the rack to the instrument platform. Assign a separation program for each sample on the rack adding a rinse step between each sample and after the last sample. Select run to start the cell separation and okay or continue to confirm that enough buffer is available.When the program is complete, remove the rack and place the positive fraction containing both the bacteria and the beads on ice. After priming the lines as just demonstrated, with the manufacturer's run and wash buffers, select power and yes to shut down the instrument and confirm that there is 70%ethanol in the storage solution bottle for decontamination. When the system shutdown is complete, the bottles will be purple.The machine can be turned off. Then use the entire positive sort fraction to inoculate one liter of LBCM25 supplemented with D glucose for overnight culture at 37 degrees Celsius with shaking. To analyze the affinity reagent isolation success after each sorting round, at the end of the post sort peptide induction, add five microliters of induced cells to 25 microliters of the solutions as shown in the table.After a 45 minute incubation on ice, collect the bacteria in each solution by centrifugation and aspirate the super nadent from each sample. With the sample tubes on ice, select administrator on the FAX instrument software and open the appropriate analysis folder. Click new experiment.Then right-click to rename the experiment and click global worksheets. Click the dot plot icon in the global worksheet spreadsheet to create a new scatter plot. Then select the dot plot graph itself and select the inspector icon.Click the boxes next to the X and Y axes in the open window to adjust the axes to a bi-exponential display and close the inspector window. Click on the experiment and create a new specimen, right-clicking to rename the specimen as experimentally appropriate. Then click the plus sign to expand the specimen and rename the sample.To run a negative control sample, re-suspend the PBS-only pellet in 500 microliters of ice cold FAX running buffer mixing well by pippetting. Transfer sample to a FAX tube, flicking to keep cells in solution, and load the sample onto the sample injection tube or SIT, of the instrument. Double click on the current sample tube and click acquired data.Then display the events in the previously prepared side scatter area versus forward scatter area dot plot, adjusting the photo multiplier tube voltage threshold under the threshold tab as needed so that the negative control cells fall near the center. When the sample is reading properly, adjust the flow rate to display 200-2, 000 events per second and click record data to capture a minimum of 10, 000 events. When all of the events have been acquired, remove the sample tube from the SIT.Select the polygon gate icon and draw a gate around the majority of the cell population in the scatter plot. Right-click on the dot plot to select show population hierarchy and click on P1 in the population hierarchy and create a new dot plot to display the P1 population. Right-click on each axis to change the Y-axis to FITC area and the X-axis to forward scatter area and adjust the axes to a bi-exponential display.Use the polygon gate to gate the negative control cells as tightly as possible around the top and left sides of the population, and select P2 in the population hierarchy, right-clicking to select invert gate. Less than 1%of the population should fall outside the gate. Right-click on the dot plot with the P2 gate to select show populations and select the P2 and not P2 populations for display.Then right-click the dot plot with the P2 gate to select create statistics view and right-click the statistics view window to select edit statistics view. Under the populations tab, add or remove the populations as appropriate, including the P1 parent population. P2 and not P2 should already be shown.Then under the statistics tab, add FITC area medium and any other statistics of interest and click okay to close the window. Right-click on the P2 scatter plot and select duplicate to create a similar dot plot graph for PE area versus FSC area. Adjust the Y-axis and use the PBS alone sample to gate the P3 population.Then invert the gate. And display the appropriate populations. When all of the appropriate gates have been set use the spreadsheet to run all of the samples recording about 10, 000 events per tube.As in this representative experiment, Ypet Mona binding to a fixed positive control peptide can help monitor the expression level of the induced peptide library within the population. Cells lacking surface displayed peptides are generally eliminated during the sorting process as observed in rounds three and four. Enrichment of the library for peptides binding to the specific target of interest is typically achieved within three positive sorting rounds.Continuing to a fourth round of sorting can be beneficial as the highest affinity peptide sequences already present in round three are likely to be further enriched in round four, aiding in down selection of potential candidates. Specificity is assessed by comparing binding to the intended target to binding to any potential cross reactive targets such as those that were used for negative sorting. Analysis of sequences from sorting round four typically reveals repeating sequences which are excellent starting points for affinity and specificity analyses.Sequence alignment analysis of the repeating sequences can be used to reveal the presence of a consensus sequence that can aid in the down selection of candidates. A representative colony from each repeating sequence can then be further analyzed by facts of on-cell affinity and specificity to assess peptide binding to target and cross reactive proteins. Once mastered, a full bio experiment with the initial affinity and specificity analysis can be performed in less than two weeks if it is executed properly.When performing the full procedure, it is important to remember that you may need to alternate between the binding assessment and sequence analyses several times to fully understand the transit involved in the binding affinity. We're included a supplemental macro file that we have developed to automate much of the peptide analysis and to further streamline the candidate selection. After watching this video, you should have a good understanding of how to rapidly isolate peptide capture agents from a bacterial display library and how to eliminate non-specific candidates from further downstream analysis.After following this procedure, other methods such as ALIZA can be performed to confirm off cell binding affinity and specificity.