Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Soluble N- etilmaleimida sensible proteína (NSF) accesorio proteína del receptor (trampa) proteínas de fusión son clave para el tráfico de la membrana, ya que catalizan la fusión de la membrana en las células eucariotas. La familia de proteínas SNARE consiste en alrededor de 36 miembros. Rutas de transporte intracelulares específicos son catalizadas por conjuntos específicos de 3 o 4 proteínas SNARE que contribuyan a la especificidad y fidelidad de la membrana trata. Sin embargo, estudiar la función precisa de proteínas SNARE es técnicamente difícil, porque trampas son muy abundantes y funcionalmente redundante, con más trampas que múltiples y superposición de funciones. En este protocolo, se describe un nuevo método para la visualización de la formación de complejos de trampa en células vivas. Este método se basa en la expresión de proteínas SNARE C-terminal Unidas a proteínas fluorescentes y medir su interacción por energía de resonancia Förster transferencia (traste) empleando vida de fluorescencia microscopía (FLIM) la proyección de imagen. Encajando los histogramas de por vida de fluorescencia con un modelo de decaimiento multicomponente, FRET-FLIM permite (semi-) estimación cuantitativa de la fracción de la formación del complejo SNARE en diferentes vesículas. Este protocolo se ha aplicado con éxito para visualizar la formación compleja de la trampa en la membrana plasmática y en compartimientos endosomal en células mamíferas y las células inmunes primarias y puede ser fácilmente extendido para estudiar funciones de trampa en otros organelos en animal, vegetal y células fúngicas.