Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

Summary

We beschrijven de optische beeldvorming van muizen besmet met Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) met behulp van verslaggever enzym fluorescentie (REF). Dit protocol vergemakkelijkt de gevoelige en specifieke detectie van M. tuberculosis in pre-klinische diermodellen voor pathogenese, therapeutics en vaccin onderzoek.

Abstract

Verslaggever enzym fluorescentie (REF) maakt gebruik van substraten die specifiek voor enzymen aanwezig in de doelsoort behorende organismen van belang voor de beeldvorming of detectie door fluorescentie- of bioluminescentie zijn. We gebruik maken van zwart, een enzym constitutively uitgedrukt door alle M. tuberculosis stammen. REF kunt snelle kwantificering van bacteriën in de longen van geïnfecteerde muizen. Dezelfde groep van muizen kan op vele punten van de tijd, sterk verminderen van kosten, opsommen van bacteriën sneller, waardoor nieuwe opmerkingen in gastheer-pathogeen interacties en de intensivering statistisch onderscheidingsvermogen, aangezien meer dieren per groep worden gemakkelijk onderhouden worden beeld . REF is uiterst gevoelig het katalytische karakter van de enzymatische verslaggever van zwart en specifieke als gevolg van de aangepaste flourescence resonantie energieoverdracht (FRET) of fluorogenic substraten gebruikt. REF vereist geen recombinante stammen, waarborgen van de normale gastheer-pathogeen interacties. We beschrijven de beeldvorming van M. tuberculose -infectie met behulp van een FRET substraat met maximale emissie bij 800 nm. De golflengte van het substraat kan gevoelige diepe weefsel imaging in zoogdieren. We zal aërosol infectie van muizen met M. tuberculosis, verdoving van muizen, beheer van de REF substraat en optische beeldvorming schetsen. Deze methode is met succes toegepast bij de evaluatie van de gastheer-pathogeen interacties en de werkzaamheid van antibiotica targeting van M. tuberculosis.

Introduction

De trage groei van M. tuberculosis is een grote wegversperring in snelle diagnose voor tuberculose^1,2,3. Terwijl cultuur gebaseerd diagnose duurt weken tot resultaten leidt, heeft de zuurvaste uitstrijkje diagnostische beperkingen⁴ in kinderen⁵ en co met^76,humaan immunodeficiëntie virus besmette patiënten. Optische beeldtechnologieën zijn onlangs bekroond als alternatief voor traditionele diagnosemethoden voor tuberculose^8,9. Fluorescentie en bioluminescentie kunnen worden gebruikt om het beeld optisch M. tuberculosis in levende dieren in real-time^{10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19}. Optische beeldvorming heeft het voordeel van een snelle en specifieke beoordeling van een infectie met M. tuberculosis^20,21,22.

We schetsen details voor optische beeldvorming van M. tuberculosis in levende muizen met behulp van REF. Deze methode is zeer specifieke en gevoelige^23,24 en vergelijkbaar met andere optische methoden, minder duur dan andere methoden van tuberculose (TB)²⁵, met inbegrip van computertomografie (CT)²⁶, magnetische imaging resonantie imaging (MRI)²⁷, en F-fluorodeoxyglucose positron emissie tomografie/CT (F-FDG PET/CT)²⁸. REF maakt gebruik van aangepaste TL of bioluminescente substraten die op decolleté door een bacteriële enzym, produceren een fluorescerende product^8,29. Vandaar, het heeft het voordeel van niet vereist een recombinant mycobacteriële verslaggever stam^30,31. Het substraat van de FRET beschreven bestaat uit een fluorescerende en een quencher verbonden door een β-lactam-ring die wordt gehydrolyseerd door zwart (β-lactamase), natuurlijk constitutively uitgedrukt door tuberculose-complexe Mycobacterium^{8, 32}. de bacteriën direct genereren signaal als gevolg van REF katalytische activiteit waarmee versterking door vele ordes van grootte en gevoelige detectie van M. tuberculosis.

De REF substraat gebruikt in deze studie heeft uitstekende weefsel penetratie in levende dieren en verminderde achtergrond als gevolg van zijn lange golflengte. Met dit lang-golflengte substraat is het mogelijk om een drempel van detectie van M. tuberculosis van bijna 100 kolonievormende eenheden (kve) in vitro en < 1000 kve in de longen van muizen in vivo (hele dieren)^{8, 33}. REF kan worden gebruikt als een diagnostisch hulpprogramma voor sputum, klinische materialen en zelfs direct bij patiënten met micro Endoscopische systemen^16,32,33,34 vanwege haar hoge gevoeligheid en specificiteit. REF kan worden toegepast op elke klinische tuberculose-stam, omdat het gebruik maakt van een natuurlijk geproduceerd bacteriële enzym, zwart, voor de detectie in alle stammen aanwezig. Deze kenmerken maken REF imaging een waardevol instrument in de pre-klinische tuberculose-onderzoek in het algemeen om therapeutische, evenals vaccin evaluatie en analyse van pathogenese, maar uiteindelijk ook kunnen worden toegepast op diagnose in tuberculose patiënten.

Protocol

Dierlijke studies werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren en voorschriften uiteengezet door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Texas A & M University. Beoordeling en goedkeuring van een veiligheidsbeambte van biohazard of een Commissie op uw instelling kunnen worden verlangd.

Let op: Alle procedures vereisen BSL3 insluiting. Het personeel zijn verplicht te dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen te allen tijde. Alle manipulaties worden uitgevoerd binnen de bioveiligheid kabinet (BSC) en alle slijpsel in sharps containers worden verwijderd. Werken oppervlakken en BSC worden schoongemaakt met gebufferde fenol en 70% ethanol voordat werk en na het werk. Procedures zou normaal moeten gebeuren op bioveiligheidsniveau 3 met Mycobacterium tuberculosis, maar voor illustratie en filmen doeleinden, de auteurs tonen deze procedures op bioveiligheidsniveau 2 met minder virulente bacteriën.

1. de stammen en cultuur voorwaarden

Opmerking: M. tuberculosis -stam CDC1551 wordt gebruikt in deze studie, maar elke M. tuberculosis -stam kan op dezelfde wijze worden gebruikt.

1. De bacteriën groeien in M-OADC-TW (7H 9 Bouillon aangevuld met 0,5% glycerol, 10% oliezuur dextrose complexe zonder katalase en 0,05% Tween-80) middellange staande bij 37 ° C op een OD₆₀₀ van 0,5 (~ 0,2 x 10⁷ CFU).
2. Verdun de cultuur in de M-OADC-TW (1:10 reeks verdunningen van de bacteriën). Plaat van de verdunningen van de bacteriën (10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸) in drievoud op selectieve 7 H 11 platen aan het toestaan van de bepaling van de CFU.
3. Incubeer de platen gedurende vier weken bij 37 ° C, of totdat de kolonies kunnen nauwkeurig worden geteld.
4. Centrifugeer het bacteriële entmateriaal bij 8,534 x g gedurende 5 min te verkrijgen van een pellet. Wassen van de pellet eenmaal met 10 mL zoutoplossing (0,9% NaCl) en resuspendeer de pellet in 15 mL zoutoplossing (0,9% NaCl).

2. aerosol infectie van muizen met behulp van een kamer van Madison

1. Kunnen muizen om te acclimatiseren aan de nieuwe omgeving voor een week.
2. Weeg de muizen voordat ze worden geladen in de kamer.
3. Sluit drie koorden op de stekkerdoos: de belangrijkste kamer macht, de vacuümpomp en de luchtcompressor, in die volgorde.
4. Zorgvuldig schroef de glazen pot. Breng van de glazen pot aan het biosafety kabinet en voeg de uitdaging entmateriaal geschorst in 15 mL zoutoplossing (0,9% NaCl) te bereiken ~ 10⁴ - 10⁶ CFU van bacteriën in de longen.
5. Sluit het deksel van de glazen pot in het biosafety kabinet. Koppelen van de pot aan de vernevelaar eenheid en aanpassen van de verticale roestvast stalen buis, zodat de onderkant (inname) ongeveer een kwart inch onder het niveau van de vloeistof in de pot is.
6. Laden van alle dieren die nodig zijn voor het experiment (de vergaderzaal kan bevatten maximaal 90 muizen) in de kamer en alle sloten op de deur te sluiten.
7. Controleer de belangrijkste (kamer) lucht flowmeter. Zorgen dat het midden van de float (bal) ongeveer 50 L/min loopt, gemeten op de schaal aan de linkerkant.
8. Druk op startknop op het bedieningspaneel van de kamer. Stelt het tarief van de luchtstroom door de compressor luchtstroommeter (de kleinere meter aan de linkerkant) 4 L/min op de schaal. Controleer visueel om ervoor te zorgen dat de uitdaging entmateriaal is wordt nebulized.
9. Na 15 min, als het rode lampje op de voorkant van het Configuratiescherm wordt weergegeven, maar een akoestisch signaal geeft aan het einde van de termijn, drukt u op Reset-knop op de rechter benedenhoek van het deelvenster Beheer om te resetten de timers.
10. Houdt u de kleine rode knop op de deur van de kamer vrij te geven van het vacuüm.
11. Open de deur van de kamer en verwijderen van de dieren. Plaats de muizen terug in hun kooi.
12. Verwijder de vernevelaar glazen pot en plaats in een verzegelde, lekvrije transport container. Plaats de container in de kast van de bioveiligheid en gooi de opschorting van de uitdaging in een aangewezen afval container.
13. Plaats de gebruikte vernevelaar pot in de zak van een biohazard en sluit de zak voor transport naar de autoclaaf.
14. Aan het einde van de procedure van de infectie, spray de binnenzijde van de kamer met de gebufferde fenol en 70% ethanol en laat de kamer om te zitten voor 10 minuten.
15. Vervolgens veeg beneden alle toegankelijke inwendige oppervlakken grondig. Verwijdering van alle besmette papieren handdoeken, enz. in de Prullenbak van biohazard. Autoclaaf de Prullenbak, afvalcontainer en gebruikt de vernevelaar potten.
16. Plaats de dieren terug in de kamer van de inperking tot het imaging tijd-punt.
17. Op de dag voor imaging, door de dieren in een secundaire container te overbrengen in de beeldvorming kamer.

3. dierlijke anesthesie

1. Anesthetize de muizen met Isofluraan met behulp van een aangepaste gas-anesthesie-systeem.
2. Wegen elk van de twee houtskool filter busje dat zich bevindt boven de eenheid van de verdoving.
3. Vervangen door een nieuwe bus als het gewicht 50 g boven het begingewicht is.
4. Controleer de vaporizer-eenheid om te zorgen voor voldoende Isofluraan voor de procedure.
5. Plaats de neus houder binnen de imaging kamer. Plaats het aantal kegels van de neus nodig zijn voor de procedure en verzegel de resterende openingen met de neus-blokkers.
6. Zet de zuurstofvoorziening van de hoge druk cilinder en stel deze in op 55 psi.
7. Zet de pomp van de evacuatie gelegen tegenover de verdoving eenheid en stel deze in op 8 L/min.
8. De knevel van de zuurstof gelegen tegenover de verdoving eenheid inschakelen.
9. Inschakelen van de gasstroom in de anesthesie inductie zaal tot verrekening de stroom van gas bij 1,5 L/min. beurt de gasstroom.
10. Inschakelen van de gasstroom in de beeldvorming zaal tot verrekening de stroom van gas bij 0,25 L/min. beurt de gasstroom.
11. Zet de vaporizer Isofluraan en instellen op 2-2,5%. Pas het niveau van de Isofluraan volgens het aantal en het gewicht van de dieren wordt gebruikt voor het experiment door het draaien van het wiel op de Isofluraan vaporisator (2-2,5% voor een muis met een gewicht van ~ 20 g; 4% voor een cavia met een gewicht van 300 g).
12. Plaats van de muizen in de anesthesie-zaal en sluit het deksel. Inschakelen van de gasstroom in de anesthesie-inductie-zaal.
13. Laat de muizen in de anesthesie inductie kamer voor 5-10 min tot volledig verdoofd.
14. Zodra de muizen zijn verdoofd, gelden een optische zalf voor de ogen om hen te beschermen terwijl imaging.
15. Plaats de muizen in ventrale of sternale lighouding, zodanig dat hun neus in de neus te vergemakkelijken van verdoving van muizen tijdens de imaging procedure worden geplaatst.

4. verslaggever enzym fluorescentie (REF) imaging

1. Injecteer het substraat (20 µM, 2, 5 µL/g van gewicht) door intraperitoneale injectie in de besmette, alsmede de controle muizen. De muizen zijn onder verdoving binnen de imaging kamer voor minder dan 1 min.
2. Het imaging systeem gestart.
3. Initialiseer het systeem door te klikken op initialiseren. Wacht totdat de temperatuur bar op groen draait.
   Opmerking: De imaging kamer bestaat uit een verwarmd platform te handhaven van de lichaamstemperatuur van het dier terwijl imaging.
4. Voor imaging-overname instelling, selecteer TL | Trans-verlichting voor het hele dier of Epi-verlichting voor weefsels van de longen, structuur en Overlay in het Configuratiescherm van de overname.
5. Gezichtsveld naar B voor enkele muis en lamp op hoog niveau instellen.
6. Belichtingstijd ingesteld op auto, middellange weggooien, 2-3 voor de f/stop en excitatie filter op 745 nm en emissie filters van 780 nm tot 840 nm.
7. Voor de installatie van de reeks, klik op reeks Setup, selecteert u van 9-12 Trans-verlichting punten op het gebied van de longen.
8. Klik op Acquire voor Beeldacquisitie.
9. Plaats de muis terug in de kooi na beeldvorming.
10. Controleer de muizen tot volledig hersteld of offeren voor het kwantificeren van CFU als imaging op een tijd-punt van het experiment. Het uitvoeren van een gemodificeerde Karnofsky-score voor het controleren van het welzijn van muizen post imaging.

5. analyse van REF imaging

1. De imaging software niet openen.
2. Laden image bestanden door te klikken op het pictogram van de bladeren.
3. Spectrale randverwijdering, klik op spectrale Unmixing in het hulpprogramma palet en klik op de spectra die nodig is om te unmix. Klik op start randverwijdering.
4. Optische oppervlakte wederopbouw, klikt u op op de topografie van het oppervlak.
5. Selecteer oriëntatie aan dorsale, onder voorbehoud van bont muis en klik op Generate oppervlak.
6. Afbeelding bijsnijden tekenen en afbeelding van de drempel voor een gebied van belang in te stellen. Klik op gereed.
7. Voor orgel registratie, ga naar het tabblad van de registratie in 3D optische Tools dropdown-menu.
8. Registreren van organen van belang in een atlas orgel.
9. Orgel grootte of locatie aan de gegenereerde oppervlakte topografie met transformatiegereedschap gelegen in-/ uitschakelen op de instrumenten paneel-registratie aanpassen.
10. Ga naar fluorescerende tomografie (FLADDEREN) 3D reconstructie, en selecteer analyseren tab. Selecteer de beelden worden opgenomen voor de analyse, image type genormaliseerd transmissie fluorescentie (NTF) efficiëntie, klikt u op Start.
11. Controleer op Alles selecteren en reconstrueren in gegevensvoorbeeld tabblad.
12. Voor fluorescentie kwantificering, ga naar regio van belang (ROI) hulpmiddelen, ROI kubus toevoegen aan het orgaan van belang en aanpassen van de kubus grootte ter dekking van het orgel van belang. Klik op 3D ROIs meten.
13. In de ROI metingen venster, ga naar 3D-metingen van de ROI, selecteer gegevenstype brontoestel voor voxels en metingen tot pmolM^-1cm^-1.
14. Opslaan en/of het resultaat van FLIT 3D reconstructie analyse exporteren naar een figuur of gegevens bestand.

6. kwantificering van bacteriën door CFU

1. Euthanaseren de muizen door intraperitoneale injectie van 0,1 mL pentobarbital natrium (390 mg/mL).
2. Selectievakje voor pedaal reflex door uitknijpen de stootkussens van de voeten van muizen om ervoor te zorgen er is geen reflex reactie.
3. Het longweefsel van de muizen met behulp van steriele Tang en schaar explant. Meng het longweefsel in 1 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
4. Maak 10-fold seriële verdunningen van het homogenaat longkanker in steriele 1 x PBS.
5. Voor de beplating, ter plaatse drie aliquots van 20 µL van de respectieve verdunning op de agarplaat.
6. Incubeer de platen in een incubator bij 37 ° C en monitor voor bacteriële groei.
7. Graaf de koloniën in elk ter plaatse na de incubatietijd en uitdrukken als CFU / mL door te corrigeren voor volume en verdunning met behulp van de volgende vergelijking:
   CFU / mL (C/V) = x M
   Waar C = kolonie tellingen per plek, V = volume van monster geënt op elke plaat (mL), en M = vermenigvuldigingsfactor (reciproke van de verdunning gebruikt).
   Opmerking: Als 11 kolonies worden geteld op een plek voor een monstervolume van 0,002 mL bij een monsterverdunning 10^-4, met behulp van de vergelijking, de Telling kolonies bij berekend als
   (11/0.02) x 10⁴ = 5.5 x 10⁶ CFU / mL

Discussion

Bij het gebruik van beeldvormende technieken, zoals REF, zijn er belangrijke strategieën waarmee generatie van robuuste en consistente gegevens. Optische beeldvorming produceert verstrooide licht in weefsels die invloed op de diepte van penetratie, hebben kan omdat het moeilijk is om vast te leggen in alle richtingen uitgestraalde licht. Gebruik van een in de omgeving van fluorophore voor infra-rood (NIR) substraat voor REF imaging met een golflengte van excitatie en emissie in de Querange van 700-900 nm vergemakkelijkt minimale absorptie van het fluorescerende signaal door zoogdieren weefsels. Het aangepaste ontworpen substraat werd gebouwd door een NIR fluorophore, IRDye 800Cw te koppelen aan een quencher, IRDye QC-1, door een lactam ring waardoor fluorescentie resonantie energie overdracht gebaseerde blussen. IRDye heeft uitstekende weefsel penetratie en licht verstrooiing kenmerken en hoeft niet elke duidelijk schadelijk effect hebben op zoogdieren³⁶, geruimd uit het bloed en de organen door 24 h. fluorescentie signaal aanzienlijk verhoogt 4 uur na het begin substraat-beheer, niveau bereiken van maximaal 6 uur na toediening.

De bacteriële infectieuze dosis, wijze van toediening van de infectieuze dosis en het substraat evenals tijd-punten van post-infectie door uit te voeren pilotstudies imaging moet worden gestandaardiseerd alvorens op grote, complexe, experimenten. Pilotstudies kunnen de tijd en kosten sterk te verminderen wanneer een groot aantal dieren imaging omdat een standaardprocedure voorafgaand aan bezig met de belangrijkste experiment kan worden geoptimaliseerd. Bacteriële belasting moeten worden bepaald in de organen/weefsels van belang na hele lichaam geschikt zijn met behulp van trans-verlichting en ex vivo Long geschikt zijn met behulp van epi-verlichting om te valideren van de bron van het signaal en bepalen de kwaliteit van de correlatie met bacteriële aantallen aanwezig⁸. Pilotstudies geven inzicht in de drempel van detectie, dynamisch bereik van de techniek alsmede de bepaling van de optimale proefomstandigheden voor imaging.

De belangrijkste voordelen van het gebruik van REF imaging als vergeleken met andere TL en bioluminescente strategieën zijn de hoge gevoeligheid en het vermogen om het imago van natuurlijke M. tuberculosis stammen. REF imaging maakt gebruik van het catalytically robuuste enzym zwart die is bewaard in alle klinische M. tuberculosis -isolaten en tuberculose-complex stammen. De grote gevoeligheid van REF imaging is te wijten aan het snelle katalytische tempo van zwart in combinatie met behoud van het gekloofd fluorescerende product door de gastheercel. Signaal voortdurend toeneemt zolang het substraat is beschikbaar waardoor vrijwel onbeperkt opbouw van het signaal binnen de geïnfecteerde cellen en weefsels. Deze verhoogde gevoeligheid voor REF imaging in vergelijking met alternatieve benaderingen voor imaging kunt specifieke detectie van M. tuberculosis beide in vitro en in vivo^{8,23,24, 29}.

REF imaging kan worden gebruikt voor de detectie van bacteriële zonder genetische modificaties waardoor haar directe toepassing op elke infectie model, ofwel laboratorium dieren^8,37 of menselijke klinische materialen^29,38 . REF kan worden gebruikt voor het opsporen en het beeld van een breed scala aan pathogenen^39,40, aangezien fluorogenic substraten kunnen worden ontwikkeld voor talrijke enzymatische doelen dan zwart zoals proteasen, kinases, ureases en β-galactosidases. Echter zorgvuldig moet worden nagedacht over de doelstelling om ervoor te zorgen het toont optimale kenmerken voor imaging. Zwart vertegenwoordigt een goed model enzym voor kenmerken die voor succesvolle toepassing van deze strategie zorgt. REF imaging biedt een directe uitlezing op bacteriële verontreiniging aanwezig zijn in de longen tijdens infecties, waardoor aanzienlijk sneller vooruitgang in onderzoek naar tuberculose pathogenese, aangezien de vaststelling van bacteriële aantallen vereist gewoonlijk drie tot zes weken, maar zelfs in meer snel groeiende organismen deze aanpak veel bespaart tijd. REF kan ook worden gebruikt om te discrimineren carcinomen van tuberculose, een kernprobleem in diagnose van nodulair laesies in patiënten^41,42. REF fungeert als een nieuwe tool om te versnellen translationeel tuberculose imaging en kan zelfs worden toegepast voor de mens, potentieel waardoor snelle voorspelling van therapeutische resultaten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	VETONE	501027
CNIR800	Custom synthesized
Fatal Plus solution	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth	BD	271310
OADC Middlebrook enrichment	BD	212351
Sporcidin		RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar	BD	212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262
XGI-8-gas Anesthesia System	Perkin Elmer
Living Imaging software	Perkin Elmer
Transparent nose cones	Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551	ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks	Jackson Laboratory