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Summary

Nous décrivons l’imagerie optique des souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) utilisant journaliste enzyme fluorescence (REF). Ce protocole facilite la détection sensible et spécifique de M. tuberculosis dans des modèles animaux précliniques pour recherche de vaccin, la thérapeutique et la pathogenèse.

Abstract

Fluorescence de journaliste enzyme (REF) utilise des substrats spécifiques d’enzymes présents dans les organismes cibles d’intérêt pour l’imagerie ou détection par fluorescence ou bioluminescence. Nous utilisons un BlaC, une enzyme exprimée constitutivement par toutes les souches de M. tuberculosis . Réf permet la quantification rapide de bactéries dans les poumons des souris infectées. Le même groupe de souris peut être photographié à plusieurs points dans le temps, considérablement réduire les coûts, énumérant les bactéries plus rapidement, permettant de nouvelles observations dans les interactions hôte-pathogène et augmentant la puissance statistique, depuis plus d’animaux par groupe sont facilement maintenus . REF est extrêmement sensible en raison de la nature catalytique du reporter enzymatique BlaC et spécifique en raison du transfert d’énergie de fluorescence personnalisé résonance (FRET) ou substrats fluorogéniques utilisés. REF ne nécessite pas de souches recombinantes, assurer des interactions hôte-pathogène normal. Nous décrivons l’imagerie de M. tuberculosis infection en utilisant un substrat frette avec émission maximale à 800 nm. La longueur d’onde du substrat permet l’imagerie des tissus profonds sensibles chez les mammifères. Nous énoncerons infection aérosol de souris par M. tuberculosis, anesthésie des souris, l’administration du substrat REF et imagerie optique. Cette méthode a été appliquée avec succès à l’évaluation des interactions hôte-pathogène et l’efficacité des antibiotiques ciblant M. tuberculosis.

Introduction

Le faible taux de croissance de M. tuberculosis est un obstacle majeur dans le diagnostic rapide de la tuberculose1,2,3. Alors que la culture basée diagnostic prend des semaines pour produire des résultats, frottis pour bactéries acido-résistantes a limites diagnostiques4 enfants5 et patients co-infectés par le virus de l’immunodéficience humaine6,7. Technologies d’imagerie optique ont été récemment reconnus comme une alternative aux méthodes traditionnelles de diagnostics de la tuberculose8,9. La fluorescence et la bioluminescence peuvent être utilisés pour l’image optiquement M. tuberculosis dans les animaux vivants en temps réel10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imagerie optique a l’avantage d’une évaluation rapide et précise d’une infection par M. tuberculosis20,21,22.

Nous exposons les détails pour l’imagerie optique de M. tuberculosis dans des souris vivantes à l’aide de REF. Cette méthode est très spécifique et sensible23,24 et semblable aux autres méthodes optiques, est moins cher que d’autres méthodes de la tuberculose (TB), imagerie25, y compris la tomodensitométrie (TDM)26, magnétique résonance d’imagerie (IRM)27et F-fluorodésoxyglucose TEP/CT (F-FDG TEP/CT)28. Réf utilise des substrats fluorescents ou bioluminescentes personnalisés qui, par clivage par une enzyme bactérienne, produire un produit fluorescent8,29. Par conséquent, il a l’avantage de ne pas nécessiter un journaliste mycobactérienne recombinant strain30,31. Le substrat de la frette décrit se compose d’un fluorochrome et un extincteur relié par une β-lactame qui est hydrolysé par BlaC (β-lactamase), naturellement exprimée constitutivement par la tuberculose-complexe Mycobacterium8, 32. les bactéries générer directement des signaux en raison de l’activité catalytique REF qui permet l’amplification par plusieurs ordres de grandeur et de sensibilité de détection de M. tuberculosis.

Le substrat REF utilisé dans cette étude a pénétration tissulaire excellente dans les animaux vivants et réduit à fond en raison de sa longueur d’onde. Avec ce substrat de longueur d’onde, il est possible d’atteindre un seuil de détection de M. tuberculosis de près de 100 colonies formant des unités (UFC) in vitro et < 1000 UFC dans les poumons de souris in vivo (animaux)8, 33. Réf peut servir comme outil de diagnostic pour crachat, matériaux cliniques et même directement chez les patients avec micro systèmes endoscopiques16,32,33,34 due à sa grande sensibilité et spécificité. REF peut être appliqué à n’importe quelle contrainte clinique de la tuberculose, car il utilise une enzyme bactérienne produite naturellement, BlaC, pour détection présente chez toutes les souches. Ces caractéristiques font de REF pour faciliter la thérapeutique d’imagerie en général un outil précieux dans la recherche préclinique de la tuberculose et vaccin évaluation ainsi que l’analyse de la pathogenèse, mais également en fin de compte peuvent être appliquées au diagnostic de la tuberculose patients.

Protocol

Les études animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices et règlements énoncés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Texas A & M University. Examen et approbation d’un Comité dans votre établissement ou l’agent de sécurité biologique peuvent être exigées.

ATTENTION : Toutes les procédures exigent de confinement BSL3. Le personnel est tenu de porter un équipement de protection individuelle en permanence. Toutes les manipulations sont effectuées à l’intérieur de l’armoire biosécurité (BSC) et tous les objets pointus ou tranchants sont déposés dans les conteneurs pour objets tranchants. Surfaces de travail et BSC sont nettoyés avec de l’éthanol dans la mémoire tampon de phénol et de 70 % avant d’entamer les travaux et après travaux. Procédures se ferait normalement au niveau de biosécurité 3 Mycobacteriumtuberculosis, mais pour l’illustration et de tournage, les auteurs montrent ces procédures au niveau de biosécurité 2 avec des bactéries moins virulentes.

1. des souches et des conditions de culture

Remarque : La souche CDC1551 de M. tuberculosis est utilisée dans cette étude, mais toute souche de M. tuberculosis peut être utilisé de la même manière.

  1. Cultiver les bactéries en M-OADC-TW (7H 9 bouillon additionné de 0,5 % de glycérol, dextrose 10 % d’acide oléique complexe sans la catalase et de 0,05 % de Tween-80) moyen standing à 37 ° C à une OD600 de 0,5 (~ 0,2 x 107 UFC).
  2. Diluer la culture en M-OADC-TW (série de 01:10 dilutions des bactéries). Les dilutions des bactéries de la plaque (105, 106, 107, 108) en trois exemplaires sur 11 géloses sélectives de 7 H pour permettre la détermination de l’UFC.
  3. Incuber les boîtes pendant quatre semaines à 37 ° C ou jusqu'à ce que les colonies peuvent être comptées avec précision.
  4. Centrifuger l’inoculum bactérien à 8 534 x g pendant 5 min obtenir une boulette. Laver le culot avec 10 mL de sérum physiologique (0,9 % NaCl) et Resuspendre le culot dans 15 mL de sérum physiologique (0,9 % NaCl).

2. infection aérosol de souris à l’aide d’une chambre de Madison

  1. Autoriser les souris s’acclimater à l’environnement nouveau pour une semaine.
  2. Peser les souris avant leur chargement dans la chambre.
  3. Branchez les trois cordons sur la multiprise : le pouvoir de la chambre principale, la pompe à vide et le compresseur d’air, dans cet ordre.
  4. Dévissez soigneusement le bocal en verre. Amener le bocal en verre à la biosécurité du cabinet et ajouter l’inoculum de défi suspendu dans 15 mL de sérum physiologique (0,9 % NaCl) pour atteindre ~ 104 - 106 UFC de bactéries dans les poumons.
  5. Fermer le couvercle de la Jarre de verre dans l’armoire de biosécurité. Fixez le contenant à l’unité du nébuliseur et ajuster le tube vertical en acier inoxydable pour que la partie inférieure (l’apport) soit environ un quart de pouce au-dessous du niveau du liquide dans le bocal.
  6. Charger tous les animaux nécessaires à l’expérimentation (la chambre pouvant accueillir jusqu'à 90 souris) dans la chambre et fermer tous les verrous sur la porte.
  7. Vérifier les principales (chambre) débitmètre d’air. Assurez vous que le centre du flotteur (boule) coule environ 50 L/min, mesurée sur l’échelle sur la gauche.
  8. Appuyez sur le bouton Start sur le panneau de contrôle de la chambre. Sur l’échelle de la valeur du débit d’air à travers le débitmètre d’air compresseur (le plus petit compteur à gauche) que 4 L/min. Vérifier visuellement que l’inoculum de défi est en nébulisation.
  9. Après 15 min, quand la lumière rouge sur le devant du panneau de commande s’affiche et un signal sonore indique la fin de la course, appuyez sur la touche Reset, sur le coin inférieur droit du panneau de commande pour réinitialiser les compteurs.
  10. Maintenez le petit bouton rouge sur la porte de la chambre pour libérer le vide.
  11. Ouvrez la porte de la chambre et enlever les animaux. Replacez les souris dans leur cage.
  12. Retirer le récipient du nébuliseur verre et placez-le dans un contenant scellé et étanche de transport. Placer le récipient à l’intérieur de l’enceinte de bio-sécurité et jeter la suspension de défi dans un conteneur de déchets désigné.
  13. Placer le bocal de nébuliseur utilisés à l’intérieur d’un sac de biohazard et sceller le sac pour le transport à l’autoclave.
  14. À la fin de la procédure de l’infection, l’intérieur de la chambre de pulvérisation avec de l’éthanol dans la mémoire tampon de phénol et de 70 % et permettre à la chambre de s’asseoir pendant 10 min.
  15. Ensuite, essuyez toutes les surfaces intérieures accessibles très soigneusement. Eliminez tous les essuie-tout contaminé, etc.. dans la corbeille de biohazard. Stériliser la poubelle, conteneur à déchets et utilisé des bocaux de nébuliseur.
  16. Remettre les animaux dans la salle de confinement jusqu’au temps d’imagerie-point.
  17. Le jour de l’imagerie, transférer les animaux dans un conteneur secondaire à la salle d’imagerie.

3. animaux anesthésie

  1. Anesthésier les souris à l’isoflurane en utilisant un système d’anesthésie gaz sur mesure.
  2. Peser chacun de la cuve du filtre à charbon deux situé sur le dessus de l’appareil d’anesthésie.
  3. Remplacer par une nouvelle cartouche si le poids est de 50 g au-delà de la masse initiale.
  4. Vérifier l’unité vaporisateur afin d’assurer l’isoflurane suffisant pour la procédure.
  5. Placez le support de cône de nez à l’intérieur de la chambre d’imagerie. Placer le nombre de cônes de nez requis pour la procédure et sceller les ouvertures restantes avec les bloqueurs de coiffe.
  6. Allumez l’alimentation en oxygène du cylindre à haute pression et définissez-la à 55 lb/po2.
  7. Mettre en marche la pompe d’évacuation située en face de l’unité d’anesthésie et définissez-la à 8 L/min.
  8. Activer la bascule de l’oxygène située en face de l’appareil d’anesthésie.
  9. Activer le flux de gaz vers la chambre d’induction de l’anesthésie pour régler le débit du gaz à 1,5 L/min. tour le débit de gaz au large.
  10. Activer le flux de gaz vers la chambre d’imagerie pour régler le débit du gaz à 0,25 L/min. tour le débit de gaz au large.
  11. Allumez le vaporisateur isoflurane et définissez-la à 2 à 2,5 %. Réglez le niveau d’isoflurane selon le nombre et le poids des animaux utilisés pour l’expérience en tournant le cadran sur le vaporisateur isoflurane (2 à 2,5 % pour une souris pesant environ 20 g ; 4 % pour un cobaye, pesant 300 g).
  12. Placez les souris dans la chambre de l’anesthésie et refermer le couvercle. Activer le flux de gaz vers la chambre d’induction de l’anesthésie.
  13. Laissez les souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie pendant 5-10 min jusqu'à ce que complètement anesthésiés.
  14. Une fois que les souris sont anesthésiés, appliquer un onguent optique aux yeux pour les protéger tout en imagerie.
  15. Placer les souris en décubitus ventral ou sternal telle que leur nez est placé dans la coiffe pour faciliter l’anesthésie des souris au cours de la procédure d’imagerie.

4. imagerie de fluorescence (REF) enzyme reporter

  1. Injecter le substrat (20 µM, 2,5 µL/g de poids) par injection intrapéritonéale à des patients infectés ainsi que les souris témoins. Les souris sont sous anesthésie à l’intérieur de la chambre d’imagerie pour moins de 1 min.
  2. Démarrer le système d’imagerie.
  3. Initialiser le système en cliquant sur Initialize. Attendez que la barre de température passe au vert.
    Remarque : La chambre d’imagerie consistant en une plate-forme chauffée pour maintenir la température corporelle de l’animal tout en imagerie.
  4. Pour le réglage de l’acquisition de l’imagerie, sélectionnez fluorescentes | TRANS-éclairage pour l’animal entier ou épi-illumination pour les tissus pulmonaires, Structure et Overlay dans le panneau Acquisition.
  5. B la valeur de champ pour la souris et le niveau de la lampe à haute.
  6. La valeur temps d’exposition automatique, binning moyennes, 2-3 pour la f/arrêt et filtre d’excitation à 745 filtres nm et d’émission de 780 nm à 840 nm.
  7. Pour la configuration de la séquence, cliquez sur Configuration de la séquence, sélectionnez 9-12 Trans-illumination points dans la zone du poumon.
  8. Cliquez sur acquérir pour l’acquisition d’images.
  9. Replacez la souris dans l’imagerie de la cage.
  10. Contrôler les souris jusqu'à ce que complètement guéri ou sacrifier pour quantifier l’UFC si à un moment de l’expérience d’imagerie. Réaliser un score de Karnofsky modifié pour surveiller le bien-être des souris après l’imagerie.

5. analyse de l’imagerie de REF

  1. Ouvrez le logiciel d’imagerie.
  2. Charger des fichiers de l’image en cliquant l’icône parcourir.
  3. Pour la déconvolution spectrale, cliquez sur la déconvolution spectrale dans la palette d’outils et cliquez sur les spectres pour unmix. Cliquez sur Démarrer déconvolution.
  4. Pour la reconstruction de surfaces optique, cliquez sur la topographie de Surface.
  5. Sélectionnez orientation à dorsale, sous réserve de souris fourrure et, cliquez sur Generate aire.
  6. Dessiner de rogner l’image et définir l’image de seuil pour une région d’intérêt. Cliquez sur terminé.
  7. Pour l’enregistrement de l’orgue, allez dans l’onglet enregistrement dans le menu de liste déroulante des instruments optiques 3D.
  8. Registre des organes d’intérêt dans un atlas de l’orgue.
  9. Ajuster la taille de l’organe ou l’emplacement à la topographie de surface générée à l’aide d’outil de transformation marche/arrêt situé sur les panneau-enregistrement des outils.
  10. Accédez à la tomographie fluorescente (FLIT) reconstruction 3D et sélectionnez analyse tab. sélectionner les images pour être inclus dans l’analyse, l’image type de rendement de Fluorescence de Transmission normalisée (NTF), cliquez sur Démarrer.
  11. Vérifiez sur Sélectionner tout et reconstruire dans l’onglet Aperçu des données.
  12. Pour la quantification de la fluorescence, accédez aux outils de la région d’intérêt (ROI), ajouter le cube ROI à l’organe d’intérêt et d’ajuster la taille du cube pour couvrir l’organe d’intérêt. Cliquez sur mesurer 3D ROIs.
  13. Dans la fenêtre de mesure de ROI, aller à des mesures de ROI 3D, sélectionnez le type de données à la source voxels et Mensurations à pmolM-1cm-1.
  14. Sauvegarder ou exporter les résultats des analyses de reconstruction 3D FLIT dans un fichier de données ou de la figure.

6. quantification des bactéries par UFC

  1. Euthanasier les souris par injection intrapéritonéale de 0,1 mL pentobarbital sodique (390 mg/mL).
  2. Recherchez les pédale réflexe en serrant les coussinets des pieds des souris pour assurer qu'il n’y a aucune réaction réflexe.
  3. Explantation le tissu pulmonaire des souris à l’aide de ciseaux et une pince stérile. Homogénéiser le tissu pulmonaire dans 1 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  4. Faire 10 fois des dilutions de l’homogénat de poumon dans du PBS stérile 1 x.
  5. Pour le placage, repérer trois aliquotes de 20 µL de chaque de la dilution respectif sur la gélose.
  6. Incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C et moniteur pour la croissance bactérienne.
  7. Comte les colonies dans chaque spot après la période d’incubation et expriment en UFC / mL de correction de volume et de la dilution à l’aide de l’équation suivante :
    UFC / mL = (C/V) x M
    Où C = nombre de colonies par endroit, V = volume de l’échantillon inoculé dans chaque assiette (mL) et M = facteur de multiplication (inverse de la dilution utilisée).
    Remarque : Si les 11 colonies sont comptés en un seul endroit pour un volume d’échantillon de 0,002 mL à une dilution de l’échantillon de 10-4, à l’aide de l’équation, le comptage des colonies sera calculée comme
    (11/0.02) x 104 = 5,5 x 106 UFC / mL

Representative Results

Réf imagerie de souris infectés par M. tuberculosis avec souris de contrôle non infectées sont indiquées dans la Figure 1A. Les souris infectées produit un significativement (P = 0,0057) signal de fluorescence plus élevée dans les poumons à l’infection après 6 semaines, par rapport au contrôle sur l’administration de substrat. Un cours typique de temps pour étudier l’efficacité thérapeutique contre M. tuberculosis utilisant REF pourrait être d’imagerie à la semaine 1, 2, 4, 6, 15, 24 après l’infection. Intensité de fluorescence est quantifiée à l’aide d’épi-illumination pour les tissus pulmonaires (Figure 1B). Le signal sans cesse croissant de la semaine 2 semaine 6 dans les poumons des souris infectées suggère que la REF est avec succès capable de détecter de M. tuberculosis in vivo. Une goutte dans le signal de fond des souris témoins à un moment plus tard (Figure 1B) pouvait être attribuée à l’augmentation des corps masse et volume de la souris sur une période de 6 semaines, ce qui réduit la pénétration de longueur d’onde d’excitation. Reconstruction 3D de FLIT de sources de fluorescence chez des souris infectées par M. tuberculosis est représentée dans la Figure 2A. Les séquences d’images sont acquises avec plusieurs points de trans-illumination dans la souris à l’aide de la même excitation et série de filtres d’émission. Ces séquences d’images sont ensuite utilisés pour la reconstruction 3D de FLIT pour distribution source fluorescente au sein de la matière animale. Figure 2 A-D montre les différentes directions (coronal, sagittal et transversale) de la tomographie de souris avec inscription organe poumon. Efficacité NTF correspond au contrôle de la qualité de la reconstruction sont représentées dans la Figure 2E. NTF permet de soustraire les fuites de lumière de fond des images trans-illumination à travers une image supplémentaire capturé avec filtre de densité neutre. L’image prise avec le filtre d’excitation spécifique (Figure 2E-mesuré) est normalisé à l’image de transmission mesuré avec la même émission et le filtre ouvert d’excitation (Figure 2E simulés) de donner le signal produit par le seul substrat. Le similaire mesuré et simulé profil efficacité NTF en tant l’horizontale (Figure 2F) et des profils verticaux (Figure 2G) avec presque 0 % pourcentage d’erreur (Figure 2E-% d’erreur) fournit des preuves d’une reconstruction 3D de bonne qualité avec sensibilité et localisation du signal amélioré et artefacts réduits.

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Figure 1 . Imagerie de M. tuberculosis avec la Réf. (A) imagerie in vivo de souris non infectés et infectés par M. tuberculosis à 2, 4 et l’infection après 6 semaines. La barre de couleur représente l’intensité du signal fluorescent en photons par seconde par cm2 de bas (jaune) à élevé (rouge). (B) la quantification de l’intensité de la fluorescence de souris infectés par M. tuberculosis. Fluorescence des valeurs pour les deux contrôle (noir) et infectée (rouge) est représenté ainsi que l’écart-type pour chaque point dans le temps. La signification des résultats a été déterminée par les élèves de t-test, les valeurs de p < 0,05 étaient considérés comme significatifs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 . Reconstruction 3D de FLIT de sources de fluorescence chez des souris infectées par M. tuberculosis. Tomographie de souris représentée dans des directions différentes ; A) coronal, B) sagittale et C) transversale avec inscription organe poumon D). La région 3D d’intérêt (ROI) est représentée par un cube rouge dans le poumon pour les mesures de la source. (E) efficacité NTF cartes des mesurée et simulé pour vérifier la qualité de la reconstruction. Le profil d’efficacité NTF mesuré et simulé a été comparé, providing de bonne qualité de reconstruction 3D (efficacité similaire mesurée et simulée NTF). Signal vertical Horizontal F) et G) profils représentant mesurée (en bleu) et simulé la courbe d’efficacité NTF (rouge). Les barres horizontales et verticales rouges indiquent la position de la source. La barre de couleur représente l’intensité du signal fluorescent en photons par seconde par cm2 de basse (bleu) à élevé (rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Lors de l’utilisation des techniques d’imagerie, comme REF, il y a des stratégies clés qui permettent de générer des données solides et cohérentes. Imagerie optique produit une lumière diffusée dans les tissus qui peut influer sur la profondeur de pénétration, car il est difficile de capter la lumière émise dans toutes les directions. Utilisation d’un fluorophore d’infra-rouge proche (NIR) substrat Ref imagerie ayant une longueur d’onde d’excitation et d’émission dans la Querange de 700 à 900 nm facilite l’absorption minimale du signal fluorescent de tissus de mammifères. Le substrat conçu personnalisé a été construit en reliant un fluorophore NIR, IRDye 800Cw à un extincteur, IRDye QC-1, par un lactame permettant de fluorescence par résonance énergétique axée sur le transfert trempe. IRDye a pénétration tissulaire excellente et caractéristiques de diffusion de la lumière et n’a pas de tout effet nocif évident sur mammifères36, dépolluées par 24 h. Fluorescence du sang et organes signal significativement augmentations débuté 4 h après administration de substrat, atteignant maximale niveaux 6 h après l’administration.

La dose infectieuse bactérienne, le mode d’administration de la dose infectieuse et le substrat ainsi que des moments d’imagerie après l’infection en effectuant des études pilotes devraient être normalisés avant d’entreprendre des expériences importantes et complexes. Études pilotes peuvent réduire considérablement les délais et les coûts lorsqu’un grand nombre d’animaux d’imagerie parce qu’une procédure standard peut être optimisée avant de faire l’expérience clé. Charge bactérienne doit être déterminée dans les organes/tissus d’intérêt suite à l’imagerie corps entier à l’aide de trans-illumination et ex vivo l’imagerie pulmonaire utilisant des épi-illumination pour valider la source du signal et de déterminer la qualité de la corrélation avec le nombre de bactéries présentes8. Études pilotes permettra de mieux comprendre dans le seuil de détection, de la plage dynamique de la technique ou de déterminer les conditions expérimentales optimales pour l’imagerie.

Les principaux avantages de l’utilisation de REF imagerie comme par rapport à d’autres stratégies fluorescents et bioluminescents sont sa haute sensibilité et sa capacité de représenter naturel M. tuberculosis souches. Réf d’imagerie utilise l’enzyme catalytiquement robuste BlaC qui est conservée dans tous les isolats cliniques de M. tuberculosis et des souches du complexe tuberculosis. La grande sensibilité de REF imagerie est due au taux rapid catalytique de BlaC en combinaison avec la rétention du produit fluorescent clivé par la cellule hôte. Signal en continu augmente aussi longtemps que le substrat est disponible, ce qui entraîne une accumulation presque illimitée de niveau du signal dans les cellules infectées et les tissus. Cette sensibilité accrue de REF imagerie par rapport aux autres approches d’imagerie permet de détection spécifique de M. tuberculosis les deux in vitro et in vivo,8,23,24, 29.

Réf d’imagerie peut être utilisé pour la détection bactérienne sans modifications génétiques permettant son application directe sur n’importe quel modèle d’infection, ou l’autre laboratoire animaux8,37 ou le matériel clinique humain29,38 . REF peut être utilisé pour détecter et un large éventail d’agents pathogènes39,40, l’image étant donné que les substrats fluorogéniques peuvent élaborer de nombreuses cibles enzymatiques autres que BlaC comme les protéases, kinases, ureases et β-galactosidases. Mais attention il faudrait réfléchir à la cible afin de s’assurer il affiche des caractéristiques optimales pour l’imagerie. BlaC représente une enzyme bon modèle pour les caractéristiques qui assurera l’application réussie de cette stratégie. Réf d’imagerie fournit une lecture immédiate sur la charge bactérienne présente dans les poumons lors d’infections, qui accélère grandement des progrès dans l’étude de la pathogenèse de la tuberculose, étant donné que la détermination du nombre de bactéries exige normalement de trois à six semaines, mais même dans les plus les organismes en croissance rapide, cette approche permettra d’économiser beaucoup de temps. REF pourrait également servir à discriminer des carcinomes de la tuberculose, un problème majeur dans le diagnostic des lésions nodulaires dans les patients41,,42. REF est un nouvel outil pour accélérer l’imagerie de la tuberculose translationnelle et peut même être appliqué aux humains, permettant potentiellement prédiction rapide des résultats thérapeutiques.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
IsofluraneVETONE501027
CNIR800Custom synthesized
Fatal Plus solutionVortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook brothBD271310
OADC Middlebrook enrichmentBD212351
SporcidinRE-1284F
7H11 Middlebrook AgarBD212203
Madison Chamber
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262
XGI-8-gas Anesthesia SystemPerkin Elmer
Living Imaging softwarePerkin Elmer
Transparent nose conesPerkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeksJackson Laboratory

References

  1. Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
  2. Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
  3. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
  4. Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
  5. Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
  6. Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
  7. Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
  8. Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
  9. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
  10. Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
  11. Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
  12. Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
  13. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).
  14. Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).
  15. Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).
  16. Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).
  17. Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
  18. Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
  19. Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
  20. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
  21. Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).
  22. Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
  23. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
  24. Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
  25. Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
  26. Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
  27. Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
  28. Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
  29. Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
  30. Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
  31. Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).
  32. Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
  33. Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).
  34. Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
  35. Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
  36. Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
  37. Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717 (2017).
  38. Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. , (2015).
  39. Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
  40. Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
  41. Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
  42. Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).

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