הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Summary

אנו מתארים את הדמיה אופטית של עכברים נגועים עם שחפת Mycobacterium (מ. שחפת) באמצעות כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט). פרוטוקול זה מאפשר את זיהוי רגיש וספציפי של מ. שחפת במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים למחקר פתוגנזה, therapeutics וחיסון.

Abstract

כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט) מנצל סובסטרטים ספציפיות עבור אנזימים המצויים אורגניזמים היעד עניין לדימות או זיהוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית או ביולומינסנציה. אנו מנצלים BlaC, אנזים צורונים לידי כל זני מ. שחפת . REF מאפשר כימות מהירה של חיידקים בריאות של עכברים נגועים. לאותה הקבוצה של עכברים יכולים לדימות בנקודות זמן רבים, הפחתת עלויות, ספירת חיידקים מהר יותר, ומאפשר תצפיות הרומן באינטראקציות פתוגן-פונדקאי ו הגברת עוצמה סטטיסטית, מאז יותר חיות לכל קבוצה נשמרים בקלות מאוד . שופט הוא רגיש בשל אופיו קטליטי של הכתב אנזימטי BlaC מאוד מסוים עקב העברת האנרגיה של תהודה flourescence מותאם אישית (סריג) או fluorogenic סובסטרטים בשימוש. שופט אינו דורש זנים רקומביננטי, הבטחת אינטראקציות פתוגן-פונדקאי נורמלי. אנו מתארים ההדמיה של מ. שחפת זיהום באמצעות מצע סריג עם פליטות מקסימלי 800 ננומטר. אורך הגל של המצע מאפשר הדמיה רקמות עמוק רגיש אצל יונקים. אנחנו מתאר תרסיס זיהום של עכברים עם מ. שחפת, הרדמה של עכברים, הניהול של המצע REF, וכן הדמיה אופטית. שיטה זו הוחלה בהצלחה על הערכת פתוגן-פונדקאי אינטראקציות והיעילות של אנטיביוטיקה מיקוד מ. שחפת.

Introduction

שיעור הצמיחה האיטית של מ. שחפת נמצא מחסום מרכזי אבחון מהיר של שחפת-^1,-^2,-³. בעוד תרבות לפי האבחנה לוקח שבועות כדי להפיק תוצאות, השמצות acid-fast יש מגבלות האבחון⁴ ילדים⁵ ו חולים שנדבקו במשותף עם וירוס הכשל החיסוני האנושי^6,7. טכנולוגיות הדמיה אופטית הוכרו לאחרונה כחלופה מסורתיים שיטות אבחון עבור שחפת^8,9. קרינה פלואורסצנטית ו ביולומינסנציה יכול לשמש כדי שטיחות תמונה מ. שחפת בבעלי חיים בזמן אמת^{10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19}. דימות אופטי יש את היתרון של הערכה מהירה, מדויקת של זיהום עם מ. שחפת^20,21,22.

אנחנו חלוקה לרמות פרטים עבור הדמיה אופטית של מ. שחפת בעכברים בשידור חי באמצעות מספר סידורי. שיטה זו היא רגישה וספציפית ביותר^23,24 , בדומה לשיטות אחרות אופטי, הוא פחות יקר מאשר שיטות אחרות של שחפת (TB) הדמיה²⁵, לרבות טומוגרפיה (CT)²⁶, מגנטי תהודה הדמיה (MRI)²⁷, סי-טי טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET/CT F-FDG) F-fluorodeoxyglucose²⁸. REF מנצל סובסטרטים או זוהרים פלורסנט מותאם אישית אשר בעת ביקוע על ידי אנזים בקטריאלי, לייצר את המוצר פלורסנט^8,29. לפיכך, יש את היתרון של שאינם דורשים^30,זן רקומביננטי כתב mycobacterial³¹. המצע סריג תיאר מורכבת fluorochrome כ'חטיף המחוברים באמצעות טבעת β-לקטם hydrolyzed מאת BlaC (β לקטמאז), באופן טבעי צורונים לידי מורכבת שחפת Mycobacterium^{8, 32}. החיידק לייצר ישירות אות עקב פעילות קטליטית REF המאפשר הגברה על ידי רבים סדרי גודל, זיהוי רגיש של מ. שחפת.

המצע REF השתמשו במחקר זה יש חדירה מעולה רקמה בבעלי חיים, מופחתת רקע בשל אורך גל ארוך שלה. עם סובסטרט זה ארוך באורך הגל זה אפשרי להשיג את הסף של זיהוי עבור מ. שחפת של כמעט 100 מושבת יחידות (CFU) במבחנה , < 1000 CFU בריאות של עכברים ויוו (כל בעלי חיים)^{8, 33}. שופט יכול לשמש ככלי אבחון עבור ברוק, חומרים קליני, אפילו ישירות בחולים עם מיקרו מערכות אנדוסקופי^16,32,33,34 בשל רגישות גבוהה וספציפיות שלה. REF ניתן ליישם כל זן קליני של שחפת, כי היא משתמשת אנזים בקטריאלי המיוצר באופן טבעי, BlaC, לצורך זיהוי נוכח כל זני. מאפיינים אלו REF הדמיה כלי רב ערך במחקרים קליניים שחפת באופן כללי כדי להקל על טיפולית, חיסון הערכה, כמו גם ניתוח של פתוגנזה, אך ניתן להחיל גם בסופו של דבר את האבחנה של שחפת מטופלים.

Protocol

מחקרים שנעשו בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה של טקסס A & ז אוניברסיטת. סקירה ואישור הממונה על הבטיחות הביולוגי או ועדה במוסד שלך עשוי להידרש.

שים לב: כל ההליכים דורשים BSL3 הבלימה. אנשי נדרשים ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת. כל המניפולציות מבוצעים בפנים אבטחה הקבינט (BSC) ואת כל שרפ יושלכו בצורה במיכלים שרפ. משטחי עבודה, BSC מנוקים עם אתנול פנול ו- 70% במאגר לפני ביצוע העבודה, אחרי העבודה. הליכים בדרך כלל ייעשה ברמה אבטחה 3 עם שחפת Mycobacterium, אך עבור איור ומטרות הצילומים, המחברים מדגימים הליכים אלה ברמת אבטחה 2 עם חיידקים פחות ארסית.

1. זנים, תרבות תנאים

הערה: מ. שחפת זן CDC1551 נעשה שימוש במחקר זה, אך כל זן מ. שחפת יכול לשמש באופן זהה.

1. לגדל את החיידקים ב- M-OADC-TW (7 שעות 9 מרק בתוספת גליצרול 0.5%, 10% חומצה אולאית דקסטרוז מורכבים ללא קטלאז, 0.05% Tween-80) בינוני שעומדים 37 ° C עד יתר₆₀₀ של 0.5 (~ 0.2 x 10⁷ CFU).
2. לדלל את התרבות ב- M-OADC-TW (סדרה של 1:10 דילולים של החיידק). לוחית רישוי של דילולים של החיידקים (10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸) דולר על גבי צלחות 11 סלקטיבי של 7 שעות כדי לאפשר קביעת CFU.
3. דגירה הצלחות במשך ארבעה שבועות ב 37 מעלות צלזיוס, או עד מושבות ניתן לספור במדויק.
4. Centrifuge את inoculum חיידקי ב g x 8,534 במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה. לשטוף את גלולה פעם אחת עם 10 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) ו מחדש להשעות את צניפה ב 15 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl).

2. תרסיס זיהום של עכברים באמצעות תא מדיסון

1. לאפשר עכברים כדי להתאקלם הסביבה החדשה לשבוע.
2. שוקלים העכברים לפני טעינת אותם אל החדר.
3. לחבר מיתרי שלוש לתוך רצועת הכוח: הכוח בחלל המרכזי, את משאבת ואקום, מדחס אוויר, לפי הסדר הזה.
4. בזהירות להתיר את צנצנת הזכוכית. להביא את צנצנת הזכוכית אבטחה ארון ולהוסיף את inoculum אתגר הושעו ב 15 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) כדי להשיג ~ 10⁴ - 10⁶ CFU של חיידקים בתוך הריאות.
5. סגור את מכסה צנצנת הזכוכית ב אבטחה הקבינט. לצרף את הצנצנת יחידת מפוחים ולהתאים את צינור נירוסטה אנכי כך הקצה התחתון (צריכת) הוא כרבע סנטימטר מתחת לגובה של הנוזל בצנצנת.
6. לטעון את כל החיות לצורך הניסוי (החדר יכול להחזיק עכברים עד 90) אל החדר וסגור את כל הבריחים בדלת.
7. בדוק הראשי (חדר) מד זרימת אוויר. ודא כי במרכז הבמה (כדור) מפעילה כ 50 ליטר/דקה כפי שנמדד בסולם בצד השמאל.
8. לחץ על כפתור התחל בלוח הבקרה של התא. הגדר את קצב זרימת האוויר דרך המונה זרימת האוויר מדחס (המונה קטן בפינה השמאלית) 4 L/min בסולם. בדוק חזותית כדי לוודא כי הוא להיות nebulized inoculum האתגר.
9. לאחר 15 דקות, כאשר מופיע האור האדום בחזית של לוח הבקרה אות נשמע מציין את סוף המרוץ, לחץ לחצן איפוס בפינה הימנית התחתונה של החלונית ' בקרה ' כדי לאפס את הטיימרים.
10. החזק את לחצן אדום קטן על הדלת של החדר כדי לשחרר את הואקום.
11. פתח את הדלת קאמרית ולהסיר את החיות. הצב והעכברים בחזרה לתוך הכלובים.
12. הסר את צנצנת הזכוכית מפוחים ומניחים במיכל אטום, עמיד בפני נזילה תחבורה. הכנס את המיכל בפנים הארון ביולוגית ולמחוק את המתלים אתגר לתוך מיכל פסולת המיועדת.
13. מניחים את הצנצנת מפוחים בשימוש בתוך שקית חומרים מסוכנים, לסגור את השקית על התחבורה החיטוי.
14. בסוף ההליך זיהום, לרסס הפנימי של החדר עם אתנול פנול ו- 70% במאגר ומאפשרים לתא לשבת 10 דקות.
15. לאחר מכן, נגב את כל משטחי הפנים נגיש באופן יסודי ביותר. היפטרו מכל מגבות נייר מזוהמים, וכו '. בפח האשפה חומרים מסוכנים. אוטוקלב האשפה, פסולת מיכל ומשמשת מפוחים צנצנות.
16. מקם את החיות בחדר ההכלה עד נקודת-הזמן הדמיה.
17. ביום הדמיה, העברת החיות במיכל משני לחדר ההדמיה.

3. בעלי חיים הרדמה

1. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין באמצעות מערכת אישית גז הרדמה.
2. שוקלים כל אחד המיכל מסנן פחם שני הממוקמת על גבי יחידת הרדמה.
3. החלף מיכל חדש אם המשקל הוא 50 גרם מעל המשקל ההתחלתי.
4. בדוק את יחידת מכשיר אידוי כדי להבטיח איזופלוריין מספיק עבור ההליך.
5. הצב בעל האף חרוט בתוך החדר הדמיה. מספר של הקונוסים האף הנדרש לקבלת ההליך, לסגור את הפתחים שנותרו עם חוסמי האף חרוט.
6. להפעיל את אספקת החמצן מן הגליל בלחץ גבוה ולהגדיר אותו בבית 55 psi.
7. תדליק את המשאבה פינוי ממוקם מול יחידת הרדמה ולהגדיר אותו 8 L/min.
8. הפעל את דו-מצבי של חמצן ממוקם מול יחידת הרדמה.
9. הפעל זרימת הגז אל התא אינדוקציה הרדמה יפעילו זרימת גז על 1.5 ליטר לדקה להפוך זרימת הגז.
10. הפעל זרימת הגז לחדר ההדמיה יפעילו זרימת גז על 0.25 L לדקה להפוך זרימת הגז.
11. הפעל את מכשיר אידוי איזופלוריין ולהגדיר אותו ב- 2-2.5%. התאם את רמת איזופלוריין בהתאם למספר ואת המשקל של חיות המשמשות את הניסוי על-ידי סיבוב החוגה על מכשיר אידוי איזופלוריין (2-2.5% לעכבר השוקל ~ 20 g; 4% עבור שפן במשקל של 300 גרם).
12. מקום העכברים בבית הבליעה הרדמה, סגור את המכסה. הפעל זרימת הגז אל התא אינדוקציה הרדמה.
13. יוצאים העכברים בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה למשך 5-10 דקות עד מורדם לחלוטין.
14. ברגע העכברים הם מרדימים, להחיל משחה אופטי לעיניים כדי להגן עליהם תוך הדמיה.
15. מקום העכברים recumbency הגחוני או בחזה ובצלעות כך אפם מוצבים בתוך אצטרובל האף כדי להקל על הרדמה של עכברים במהלך ההליך הדמיה.

4. כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט) הדמיה

1. להזריק את המצע (20 מיקרומטר, 2.5 µL/גר' משקל) על ידי הזרקת בקרום הבטן לתוך הנגועים, כמו גם בקרת עכברים. העכברים הם תחת הרדמה בתוך החדר הדמיה עבור פחות מ- 1 דקות.
2. להפעיל את מערכת הדמיה.
3. לאתחל את המערכת על ידי לחיצה על אתחל. המתן עד הבר טמפרטורה הופך לירוק.
   הערה: תא הדמיה מורכבת פלטפורמה מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה בזמן ההדמיה.
4. הדמיה רכישה הגדרה, בחר פלורסנט | טרנס-תאורה עבור כל החיה או אפינפרין-תאורה בשביל לרקמות ריאות, המבנה של כיסוי בלוח הבקרה רכישה.
5. הגדר שדה ראייה B עבור עכבר אחת ורמת מנורה גבוהה.
6. להגדיר זמן חשיפה אוטומטית, binning בינוני, 2-3 f/להפסיק, שיטות עירור במסנן ב nm 745 ומסננים פליטה 780 nm 840 ננומטר.
7. עבור התקנת רצף, לחץ על רצף ההתקנה, בחר 9-12 נקודות הטרנס-תאורה באזור הריאה.
8. לחץ על ייבוא עבור רכישת התמונה.
9. הנח את העכבר בחזרה לתוך כלוב ההדמיה שלאחר.
10. לפקח על העכברים עד החלים לחלוטין או להקריב עבור לכימות CFU אם הדמיה ב נקודת הזמן של הניסוי. לבצע ניקוד Karnofsky ששונה כדי לפקח לרווחתם של עכברים פוסט-הדמיה.

5. ניתוח של שופט הדמיה

1. פתח את תוכנת הדמיה.
2. לטעון קבצי תמונה על-ידי לחיצה על עיון סמל.
3. עבור unmixing ספקטרלי, לחץ על הפירוק הספקטרלי Unmixing הצבעים כלי ולחץ על ספקטרום הנדרש כדי unmix. לחץ על התחל unmixing.
4. שיקום משטח אופטי, לחץ על השטח הטופוגרפי.
5. בחר כיוון כדי הגבי, בכפוף פרווה העכבר, לחץ על פני שטח של צור.
6. לצייר תמונה חיתוך ולהגדיר סף תמונה עבור אזור של עניין. לחץ על בוצע.
7. לרישום איברים, עבור אל הכרטיסיה רישום תלת-ממד בתפריט הנפתח כלים אופטי.
8. הירשם איברים עניין באטלס איברים.
9. התאם גודל איבר או מיקום הטופוגרפיה משטח שנוצרו באמצעות הכלי שינוי צורה/ביטול ממוקם על הכלים לוח רישום.
10. ללכת טומוגרפיה פלורסנט (פליט) שחזור תלת-ממד, ולנתח בחר בכרטיסיית בחר את התמונות כדי להיכלל לניתוח, תמונה סוג ליעילות פלורסצנטיות שידור מנורמל (NTF), לחץ על התחל.
11. לבדוק כל בחירה, לשחזר בכרטיסיה תצוגה מקדימה של נתונים.
12. על ידי קרינה פלואורסצנטית כימות, ללכת לכלים של אזור ריבית (ROI), להוסיף קוביה רועי האיבר עניין, להתאים את גודל הקוביה כדי לכסות את האיבר של עניין. לחץ על מדוד ROIs תלת-ממד.
13. בחלון המידות רועי, ללכת למדידות רועי תלת-ממדיים, בחר סוג נתונים מקור יחידת voxels ומדידות pmolM^-1ס מ^-1.
14. שמירה ו/או לייצא את התוצאה של פליט ניתוח שחזור תלת-ממד לקובץ נתונים או איור.

6. כימות של חיידקים על ידי CFU

1. המתת חסד העכברים מאת בקרום הבטן הזרקת סודיום פנטוברביטל 0.1 מ"ל (390 מ"ג/מ"ל).
2. בדוק אם פדלים רפלקס לוחצת את רפידות של כפות הרגליים של עכברים כדי להבטיח שאין תגובה רפלקס.
3. Explant רקמת הריאה מן העכברים באמצעות מלקחיים סטרילי ומספריים. Homogenize רקמת הריאה ב 1 מ"ל של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
4. להפוך דילולים טורי 10-fold של homogenate הריאה עקר 1 x PBS.
5. עבור ציפוי, במקום שלוש aliquots של 20 µL כל של דילול בהתאמה על הצלחת אגר.
6. דגירה הלוחות באינקובטור 37 ° C, צג לצמיחה בקטריאלי.
7. ספירת מושבות בכל נקודה לאחר זמן הדגירה ולבטא כמו CFU / mL על-ידי תיקון עבור אמצעי אחסון ודילול באמצעות המשוואה הבאה:
   CFU / מ"ל = (C/V) x-M
   איפה C = המושבה ספירות לכל מקום, V = אמצעי אחסון מדגם מחוסן על כל צלחת (mL) ו- M = פקטור הכפלה (הדדיים של הדילול בשימוש).
   הערה: אם המושבות 11 נספרות במקום אחד עבור נפח דגימה של 0.002 מ"ל לדילול מדגם של 10^-4, באמצעות המשוואה, הרוזן המושבה יחושבו כפי
   (11/0.02) x 10⁴ = 5.5 x 10⁶ CFU / mL

Discussion

בעת שימוש בטכניקות דימות, כגון REF, יש מפתח אסטרטגיות המאפשרות יצירה של נתונים חזקים ועקביים. הדמיה אופטית מייצרת אור הפזורים ברקמות אשר יכולים להשפיע את עומק החדירה, מאז זה קשה ללכוד את האור הנפלטת מכל הכיוונים. שימוש של fluorophore ליד אינפרא-אדום (ניר) המצע עבור REF הדמיה שיש גל של עירור, פליטה Querange של 700-900 ננומטר מקלה על הספיגה מינימלית של האות פלורסנט מאת בתרבית של רקמות. המצע מעוצב מותאם אישית נבנה על-ידי קישור של ניר fluorophore, IRDye 800Cw כ'חטיף, IRDye QC-1, על ידי טבעת לקטם ומאפשר פלורסצנטיות תהודה אנרגיה מבוססת על העברת שכבתה. IRDye יש חדירה מצוינת רקמת אור פיזור המאפיינים ואת אין כל השפעה מזיקה ניכר על יונקים³⁶, פינה ממחזור הדם, באיברים מאת h 24 פלורסצנטיות אות משמעותית מגדיל מתחיל 4 שעות לאחר המצע מינהל, להגיע מקסימלי רמות 6 שעות לאחר ניהול.

מינון זיהומית חיידקית, מצב של מינהל במינון זיהומיות ואת המצע, כמו גם בזמן נקודות של הדמיה פוסט זיהום על-ידי ביצוע מחקרים טייס צריך להיות מוגדר לפני היציאה ניסויים גדולים ומורכבים,. יכול לימודי טייס לצמצם במידה ניכרת של זמן ועלות כאשר הדמיה מספר גדול של בעלי חיים כי תהליך סטנדרטי ניתן למטב לפני הניסוי מפתח. המון חיידקים צריך להיות נחוש ברקמות/האיברים עניין בעקבות כל הגוף הדמיה באמצעות הטרנס-תאורה ו- ex-vivo ריאות הדמיה באמצעות epi-תאורה כדי לאמת את מקור האות, לקבוע את איכות המתאם עם מספרים חיידקי נוכח⁸. לימודי טייס יספקו תובנה הסף של זיהוי, טווח דינמי של הטכניקה, כמו גם קביעת התנאים ניסיוני אופטימלית עבור הדמיה.

היתרונות העיקריים של שימוש REF הדמיה כמו בהשוואה אסטרטגיות זוהרים פלורסנט אחרים הם שלה רגישות גבוהה ויכולת תמונה טבעית מ. שחפת זנים. REF הדמיה מנצל את האנזים catalytically חזקים BlaC זה כולו כל מבודד קלינית מ. שחפת , שחפת-מתחם זנים. הרגישות הגדולה של שופט הדמיה הוא שיעור קטליטי מהירה BlaC בשילוב עם השמירה של המוצר פלורסנט cleaved התא המארח. אות ללא הרף עולה ככל המצע זמין וכתוצאה מכך הצטברות כמעט בלתי מוגבל של האות בתוך תאים נגועים, רקמות. רגישות מוגברת זו של שופט הדמיה לעומת גישות אלטרנטיביות הדמיה מאפשר זיהוי ספציפי של מ. שחפת בשני במבחנה ויוו^{8,23,24, 29}.

REF הדמיה ניתן לגילוי חיידקי בלי שינויים גנטיים המאפשרים יישומו ישירה לכל זיהום מודל, מעבדה חיות^8,37 או חומרים קליני האדם^29,38 . שופט יכול לשמש לשם זיהוי של תמונה מגוון רחב של פתוגנים^39,40, מאז fluorogenic דיאלקטריים ניתנים לפיתוח עבור מטרות אנזימטיות רבות מלבד BlaC כגון פרוטאזות, kinases, ureases וβ-galactosidases. עם זאת, זהיר מחשבה צריך להינתן למטרה על מנת להבטיח הוא מציג מאפיינים אופטימלית עבור הדמיה. BlaC מייצג אנזים מודל טוב עבור מאפיינים שיבטיחו יישום מוצלח של אסטרטגיה זו. REF הדמיה מספקת read-out מיידית של במשלוח חיידקי מתנת בריאות במהלך זיהומים, אשר במידה רבה מהירויות של התקדמות במחקר של שחפת פתוגנזה, מאז קביעת מספרי חיידקי דורש בדרך כלל שלושה עד שישה שבועות, אבל אפילו יותר אורגניזמים בצמיחה מהירה, גישה זו תוכלו לחסוך הרבה מאוד זמן. שופט יכול לשמש גם כדי להפלות קרצינומות מ שחפת, בעיה מפתח באבחון של נגעים אקנה קשרי מטופלים^41,42. REF משמש ככלי הרומן להאיץ שחפת translational הדמיה, אפילו ניתן להחיל על בני אדם, פוטנציאל המאפשר חיזוי מהירה של תוצאות טיפוליות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	VETONE	501027
CNIR800	Custom synthesized
Fatal Plus solution	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth	BD	271310
OADC Middlebrook enrichment	BD	212351
Sporcidin		RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar	BD	212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262
XGI-8-gas Anesthesia System	Perkin Elmer
Living Imaging software	Perkin Elmer
Transparent nose cones	Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551	ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks	Jackson Laboratory