Микобактерии изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер

Summary

Мы описываем оптических изображений мышей, инфицированных микобактериями туберкулеза (микобактерий туберкулеза) с помощью репортер фермента флуоресцирования (REF). Этот протокол облегчает чувствительных и конкретных обнаружение микобактерий туберкулеза в доклинических животных моделей для исследования патогенеза, клинической медицины и вакцины.

Abstract

Репортер фермента флуоресцирования (REF) использует подложках, которые являются специфическими для ферменты, присутствующие в целевой организмов, представляющих интерес для изображений или обнаружения флуоресценции или биолюминесценции. Мы используем BlaC, фермент, конститутивно выраженные всех штаммов микобактерий туберкулеза . REF позволяет быстро квантификации бактерий в легких зараженных мышей. Той же группе мышей может отражаться во многих точках времени, значительно сократить расходы, перечисление бактерий более быстро, позволяя Роман наблюдений в хост патогенный взаимодействиях и повышение статистической мощности, так как легко поддерживаются более животных для каждой группы . ССЫЛКА является чрезвычайно чувствительных благодаря каталитического характера BlaC ферментативные репортер и конкретных пользовательских flourescence резонанс передачи энергии (ЛАДА) или fluorogenic субстратов используется. REF не требуют рекомбинантных штаммов, обеспечивая нормальный хост возбудитель взаимодействий. Мы описываем изображений микобактерий инфекции с помощью подложке ладу с максимальной выбросов на 800 Нм. Длина волны субстрата позволяет изображение чувствительные глубоких тканей млекопитающих. Мы очертим аэрозоля заражение мышей с микобактерий туберкулеза, анестезия мышей, администрация REF субстрат и оптических изображений. Этот метод успешно применяется для оценки взаимодействия хост возбудителя и эффективность антибиотиков, ориентация микобактерий туберкулеза.

Introduction

Медленный темп роста микобактерий туберкулеза является основным камнем преткновения в быстрой диагностики туберкулеза^1,2,3. В то время как культуре на основе диагностики занимает недели для получения результатов, Фита мазок имеет диагностических ограничения⁴ в⁵ детей и пациентов, совместно инфицированных вирусом иммунодефицита человека^6,7. Оптические технологии визуализации недавно были признаны альтернативой традиционных методов диагностики туберкулеза^8,9. Флуоресценции и биолюминесценции может использоваться для оптически изображение микобактерий туберкулеза в живых животных в реальном времени^{10,11,12,13,14, 15,16,,1718,19}. Оптическая томография имеет преимущество быстрого и конкретные оценки инфекции с микобактерий туберкулезав^20,21,22.

Мы приводим детали для оптических изображений в живых мышей, использование REF микобактерий туберкулеза. Этот метод является весьма конкретные и чувствительных в^23,24 и, похож на другие оптические методы, менее дорогостоящим, чем другие методы туберкулеза (ТБ) imaging²⁵, включая компьютерная томография (КТ)²⁶, магнитные резонанс, изображений (MRI)²⁷и позитронно эмиссионная томография/CT (F-ФДГ-ПЭТ/КТ) F-fluorodeoxyglucose²⁸. REF использует пользовательские флуоресцентные или биолюминесцентных подложках, которые после расщепления от бактериальный фермент, производят флуоресцентный продукта^8,29. Таким образом он имеет преимущество, не требующих рекомбинантных микобактериальной репортер штамм^30,31. Субстрат ладу описал состоит из флюрохром и утоления соединены β-лактамные кольцо, которое является гидролизованный BlaC (β-лактамаз), естественно, конститутивно выраженные микобактериитуберкулеза комплекс в^{8, 32}. бактерии непосредственно генерации сигнала благодаря REF каталитической активности, который позволяет усиления на много порядков и чувствительных обнаружение микобактерийтуберкулеза.

Субстрат REF, используемые в данном исследовании имеет отличные ткани проникновения в живых животных и снижение фона из-за своей длиной волны. С этот субстрат длинноволновых это можно достичь порога обнаружения для микобактерий туберкулеза почти 100 колонии, образуя единиц (CFU) в пробирке и < 1000 кое в легких мышей в vivo (все животное)^{8, 33}. REF может использоваться как средство диагностики для мокроты, клинического материала и даже непосредственно у больных с микро эндоскопических систем^16,32,,3334 из-за его высокой чувствительностью и специфичностью. REF может применяться к любой клинической штамм туберкулеза, потому что он использует естественно произведенные бактериальный фермент, BlaC, для обнаружения в всех штаммов. Эти характеристики делают REF imaging ценным инструментом исследования доклинические туберкулеза в целом для облегчения терапевтических и оценки вакцин, а также анализ патогенеза, но также в конечном итоге могут быть применены к диагностике туберкулеза пациентов.

Protocol

Исследования на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и положениями, установленными институциональный уход животных и использования Комитета Техас A & M University. Обзор и утверждение от биологической безопасности сотрудник или на вашем учреждении Комитета могут потребоваться.

Предупреждение: Все процедуры требуют BSL3 сдерживания. Сотрудники обязаны носить средства индивидуальной защиты на все времена. Все манипуляции выполняются внутри кабинета по биобезопасности (BSC) и все Шарпс удаляются в контейнерах колюще-режущих отходов. Работа поверхностей и BSC убираются с буферизацией фенола и 70% этанол до начала работы и после работы. Процедуры обычно будет осуществляться на уровне 3 биобезопасности с микобактерии, но для съемки целей и иллюстрации, авторы демонстрируют эти процедуры на уровне 2 биобезопасности с менее вирулентные бактерии.

1. штаммов и культура условия

Примечание: В этом исследовании используется штамм микобактерий CDC1551, но любой штамм микобактерий туберкулеза могут быть использованы таким же образом.

1. Рост бактерий в M-OADC-TW (7 Ч 9 бульон с 0,5% глицерина, олеиновая кислота 10% декстрозы комплекса без каталазы и 0,05% анимации-80) средних стоя при 37 ° C к ОД₆₀₀ 0.5 (~ 0,2 х 10⁷ кое).
2. Разбавить культуры в M-OADC-TW (серии 1:10 разведения бактерий). Пластина разведения бактерий (10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸) в трех экземплярах на выборочной 7 H 11 пластин позволяет определение кое.
3. Инкубируйте пластины для четырех недель при 37 ° C или до тех пор, пока колоний можно точно посчитать.
4. Центрифуга бактериальных посевным материалом на 8534 g x 5 минут для получения гранул. Помыть лепешка однажды с 10 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) и вновь приостановить гранулы в 15 мл физиологического раствора (0,9% NaCl).

2. Аэрозольные заражение мышей, используя камеру Мэдисон

1. Разрешить мышей, чтобы акклиматизироваться к новой обстановке в неделю.
2. Взвешивание мышей до их загрузки в камеру.
3. Подключите три шнуры к удлинителю: мощности основной камеры, вакуумный насос и воздушный компрессор, в этом порядке.
4. Осторожно Отвинтите стеклянную банку. Довести колбу до кабинета биобезопасности и добавьте вызов посевным материалом, приостановлено в 15 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) для достижения ~ 10⁴ - 10⁶ CFU бактерий в легких.
5. Закройте крышку стеклянную банку в кабинете биобезопасности. Прикрепите банку к блоку ингалятор и отрегулировать вертикальное нержавеющая сталь трубы так, что нижний конец (всасывание) около четверти дюйма ниже уровня жидкости в банку.
6. Загрузить все животные, необходимые для эксперимента (палата может вместить до 90 мышей) в камеру и закрыть все защелки на дверь.
7. Проверить основные (комната) расходомер воздуха. Убедитесь, что центр поплавок (шар) работает около 50 Л/мин как на шкале слева.
8. Нажмите кнопку Пуск на панели управления камеры. Установите скорость воздушного потока через расходомера воздуха компрессор (меньше метра в слева) 4 Л/мин на шкале. Проверьте визуально это время распылению вызов посевным материалом.
9. После 15 минут когда появляется красный свет на передней панели управления и звуковой сигнал указывает на конец выполнения, нажмите кнопку Reset на нижнем правом углу панели управления для сброса таймеров.
10. Удерживая кнопку маленький красный на двери камеры выпустить вакуума.
11. Откройте дверь камеры и удалить животных. Место мышей обратно в их клетках.
12. Извлеките ингалятор чашу и место в запечатанном, герметичность транспортировочный контейнер. Поместите контейнер внутри шкафа био безопасности и отменить приостановление вызов в указанный контейнер для отходов.
13. Поместите jar используется распылитель биологической мешок и уплотнения сумка для транспортировки в автоклаве.
14. В конце процедуры инфекции спрей внутри камеры с буферизацией фенола и 70% этанола и позволить камере сидеть в течение 10 мин.
15. Затем протрите все доступные внутренние поверхности очень тщательно. Утилизация всех загрязненных бумажные полотенца, и т.д. в биологической мусор. Автоклав мусор, отходы контейнер и использовать небулайзер баночки.
16. Место животных обратно в комнате, сдерживания до точки время визуализации.
17. В день изображений Передача животных в вторичного контейнера изображений комнату.

3. животных анестезии

1. Анестезировать мышей с изофлюрановая с помощью заказной газовой системы анестезии.
2. Вес каждой из двух угольный фильтр канистра, расположенных на верхней части блока анестезии.
3. Замените новую канистру, если вес 50 г выше начальный вес.
4. Проверьте блок испарителя для обеспечения достаточного изофлюрановая для процедуры.
5. Установите держатель носовой конус внутри изображений камеры. Число конусов нос, необходимые для процедуры и печатью оставшиеся отверстия с носовой конус блокаторы.
6. Включите подачу кислорода из цилиндра высокого давления и установить его на 55 psi.
7. Включите насос эвакуации, расположенный перед блоком анестезии и установить его на 8 Л/мин.
8. Включите рычаг кислорода, расположенный перед блоком анестезии.
9. Включите потока газа в камеру индукции анестезии для отключения потока газа на 1,5 Л/мин очередь потока газа.
10. Включите газового потока для изображений камеры для отключения потока газа на 0,25 Л/мин очередь потока газа.
11. Включите изофлюрановая испарителем и установите его на 2-2,5%. Отрегулируйте уровень изофлюрановая согласно количества и веса животных, используемого для эксперимента, повернув ручку на изофлюрановая испарителем (2-2,5% для мыши весом ~ 20 g; 4% для морской свинки, весом 300 г).
12. Место мыши в камере анестезии и закройте крышку. Включите потока газа в камеру индукции анестезии.
13. Оставьте мышей в зале индукции анестезии для 5-10 мин до тех пор, пока полностью под наркозом.
14. После наркоза мышей, применять оптических мазь для глаз для их защиты во время визуализации.
15. Место мыши в брюшной и грудной recumbency, таким образом, что их носы размещаются в носовой конус для облегчения анестезии мышей в процедуре обработки изображений.

4. репортер фермента флуоресцирования (REF) изображений

1. Придать субстрата (20 мкм, 2.5 мкл/г веса) внутрибрюшинной инъекции в инфицированных, а также управления мышей. Мышей находятся под наркозом внутри тепловизионные камеры для менее 1 мин.
2. Начало создания образов системы.
3. Инициализация системы, нажав на Initialize. Подождите, пока температура бар превращается в зеленый.
   Примечание: Тепловизионная камера состоит из подогретую платформу для поддержания температуры тела животного во время визуализации.
4. Выберите для визуализации параметр приобретение, люминесцентные | Транс освещение для всего животного или Epi освещение для легких тканей, структура и оверлея на приобретение панели управления.
5. Задать поле зрения B для одной мыши и лампа уровня до высокого.
6. Задать время экспозиции для авто, средний биннинга, 2-3 f/stop и возбуждения фильтр на 745 фильтры Нм и выбросов от 780 нм до 840 Нм.
7. Для последовательности установки нажмите на последовательности установки, выберите 9-12 транс освещение точек в области легких.
8. Нажмите на приобретение для захвата изображений.
9. Поместите курсор мыши обратно в клетку после обработки изображений.
10. Монитор мыши до тех пор, пока полностью восстановился или пожертвовать для количественной оценки CFU если изображений на этапе эксперимента. Выполните изменение Карновского Оценка для мониторинга благосостояния мышей пост изображений.

5. анализ REF изображений

1. Откройте изображений программное обеспечение.
2. Загрузите файлы изображений, нажав значок Обзор.
3. Для спектральных расслоение, нажмите на спектральные Unmixing в палитре и нажмите спектры, необходимые для unmix. Нажмите на Пуск расслоение.
4. Оптические поверхности реконструкции нажмите на топографии поверхности.
5. Выберите ориентацию на спинной, при условии меха мыши и нажмите кнопку Создать поверхность.
6. Нарисуйте обрезать изображение и задать порог изображение для региона интерес. Нажмите кнопку Готово.
7. Для органа регистрации перейдите на вкладку регистрации в 3D оптических инструментов в раскрывающемся меню.
8. Реестр органов интереса в атласе органа.
9. Отрегулируйте размер органа или расположение для созданного топографии поверхности с помощью инструмента Трансформация, вкл/выкл, расположенный на панели Регистрация инструменты.
10. Перейти на флуоресцентные томография 3D реконструкции (ФЛИТ), и выберите анализировать tab. Выберите изображения, чтобы быть включены для анализа, тип нормированный передачи флуоресцирования (НФПК) эффективности изображения, нажмите кнопку Пуск.
11. Проверить на выделить все и реконструировать в вкладку Предварительный просмотр данных.
12. Для количественной оценки флуоресценции идти средства региона интерес (ROI), добавить ROI куб органа интерес и отрегулировать размер куба для покрытия орган интерес. Нажмите на измерения 3D ROIs.
13. В окне измерения ROI перейдите к 3D ROI измерения, выберите тип данных для исходного вокселей и измерения единица-pmolM^-1см^-1.
14. Сохранить или экспортировать результат анализа 3D реконструкции ПОРХАЮТ в файл фигуры или данных.

6. Количественная оценка бактерий CFU

1. Усыпить мышей внутрибрюшинной инъекцией Пентобарбитал натрия 0,1 мл (390 мг/мл).
2. Проверить педаль рефлекс, сжимая колодки ноги мышей, чтобы убедиться, что нет никаких рефлекторной реакции.
3. Explant легочной ткани от мышей с использованием стерильных щипцами и ножницы. Однородный легочной ткани в 1 мл раствора 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
4. Сделайте десятикратного серийных разведений легких огневки в стерильных ПБС.
5. Для обшивки, Найди три аликвоты 20 мкл соответствующих разбавления на табличке агар.
6. Инкубируйте пластины в инкубаторе при 37 ° C и монитор для роста бактерий.
7. Количество колоний в каждом месте после время инкубации и выразить кое / мл, исправляя для тома и разрежения с помощью следующего уравнения:
   КОЕ / мл = (C/V) x М
   Где C = колонии разрядов на месте, V = объем образца, привитых на каждой пластине (мл) и M = коэффициент умножения (обратную величину размывание используется).
   Примечание: Если 11 колоний, учитываются в одном месте для объем образца 0,002 мл на образце разбавления 10^-4, с помощью уравнения, граф колонии будет рассчитываться как
   (11/0.02) x 10⁴ = 5.5 x 10⁶ кое / мл

Discussion

При использовании методы обработки изображений, например REF, есть ключевые стратегии, которые позволяют создание надежных и последовательных данных. Оптическая томография производит рассеянного света в тканях, которые могут повлиять на глубину проникновения, поскольку трудно захватить света, излучаемого во всех направлениях. Использование вблизи инфра красный Флюорофор (NIR) субстрат для изображений, имеющих длину волны возбуждения и выбросов в Querange 700-900 нм REF способствует минимальным поглощением флуоресцентного сигнала тканей млекопитающих. Пользовательские разработан субстрат был построен путем увязывания NIR Флюорофор, IRDye 800Cw для утоления IRDye QC-1, лактамные кольцо, позволяя на основе передачи тушения флуоресценции резонанс энергии. IRDye имеет отличные ткани проникновение света рассеяния характеристик и не имеют каких-либо очевидной вредное воздействие на млекопитающих³⁶, очищали от крови и органов 24 h. флуоресценции сигнала значительно увеличивается, начиная с 4 ч после Субстрат администрации, достигнув максимальной уровнях 6 ч после приема.

Прежде чем приступать на больших, сложных, эксперименты должны быть стандартизированы бактериальных инфекционных дозы, режим администрации инфекционных дозы и субстрата, а также время точек изображений пост инфекции путем проведения экспериментальных исследований. Экспериментальные исследования может значительно сократить время и затраты при визуализации большое количество животных, потому что стандартная процедура может быть оптимизирована до делать ключевые эксперимент. Бактериальной нагрузки должны определяться в органы/тканях интерес после всего тела изображений с помощью транс освещение и ex vivo томографии легких с помощью epi освещение для проверки источника сигнала и определить качество корреляции с бактериальной числа нынешних⁸. Экспериментальные исследования даст понимание порог обнаружения, динамический диапазон техники, а также определение оптимальной экспериментальных условий для изображений.

Основными преимуществами использования изображений как REF по сравнению с другими флуоресцентные и биолюминесцентных стратегии являются его высокая чувствительность и способность изображения природных микобактерий туберкулеза штаммов. Ссылка изображений использует каталитически надежные фермента BlaC, которая сохраняется во всех клинических изолятов микобактерий туберкулеза и туберкулеза комплекс штаммов. Большая чувствительность REF изображений объясняется быстрое катализатора скорость BlaC в сочетании с сохранением рассеченного флуоресцентные продукта клетки-хозяина. Сигнал непрерывно увеличивается до тех пор, как субстрат доступен, что приводит к практически неограниченную накопления сигнала внутри инфицированных клеток и тканей. Это повышенная чувствительность REF изображений по сравнению с альтернативных подходов изображений позволяет конкретного выявления микобактерий туберкулеза оба в пробирке и в vivo^{8,23,24, 29}.

Ссылка изображений может использоваться для обнаружения в бактериальные без генетических изменений, позволяя его непосредственное применение к любому инфекция модели, либо лабораторных животных^8,37 или клинических материалов человека^29,38 . REF может использоваться для обнаружения и изображения широкий спектр патогенов^39,40, так как fluorogenic субстратов могут быть разработаны для многочисленных ферментативные целей помимо BlaC такие протеаз, киназы, ureases и β-galactosidases. Однако осторожны, следует подумать с целью обеспечения он выводит оптимальные характеристики для воображения. BlaC представляет собой хорошую модель фермент для характеристик, которые обеспечат успешное применение этой стратегии. Ссылка изображений обеспечивает немедленное считывание на бактериальной нагрузки в легких во время инфекции, которая значительно ускоряет прогресс в изучении патогенеза туберкулеза, поскольку определение бактериальной чисел обычно требует трех-шести недель, но даже в более быстро растущих организмов, такой подход позволит сэкономить немало времени. ССЫЛКА может также использоваться для дискриминации карциномы от туберкулеза, ключевой проблемой в диагноз узловой поражений в больных^41,42. REF служит роман инструментом для ускорения трансляционная туберкулезом изображений и может применяться даже для людей, потенциально позволяя быстрое предсказание терапевтических результатов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	VETONE	501027
CNIR800	Custom synthesized
Fatal Plus solution	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth	BD	271310
OADC Middlebrook enrichment	BD	212351
Sporcidin		RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar	BD	212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262
XGI-8-gas Anesthesia System	Perkin Elmer
Living Imaging software	Perkin Elmer
Transparent nose cones	Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551	ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks	Jackson Laboratory