Wir sind verpflichtet, die Forschung Verband FRABio und die TisBio imaging Plattform (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des Assemblagen Biomoléculaires) für die Bereitstellung der technischen Rahmenbedingungen zur Erreichung dieses Ziels arbeiten.

Hinweis: Flüssige und feste ½ MS Medien müssen vorher wie in ergänzenden Tabelle1beschrieben vorbereitet werden.
1. die Pflanzenkultur
<ol><li>
Kultur der 2 Monate alten Flachs Pflanzen
	<ol>
<li>Säen Sie Flachs (Linum Usitatissimum L.), in Kunststoff-Töpfe mit Blumenerde Kompost.</li>
		<li>Wachsen Flachs in Klimakammern bei 22 ° C mit einer Photoperiode von 16 h/8 h Tag/Nacht.</li>
		<li>Statten Sie Pflanzen mit vertikalen Stütze nach 1 Monat und wachsen Sie, bis sie 2 Monate alt sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur von 2 Wochen alten Flachs Sämlinge
	<ol>
<li>12 Leinsamen in ein Stück Käse Tuch wickeln und mit einem Gummiband zu einem Bündel zu beheben. Hinweis: Führen Sie die nächsten Schritte unter sterilen Bedingungen unter einem Laminar-Flow-Abzug.</li>
		<li>Legen Sie die Samen-Bundle in einer zuvor autoklaviert 250 mL Glasflasche.</li>
		<li>Fügen Sie 70 mL 70 % EtOH in der Flasche und sanft für 1 min rühren.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die EtOH durch Dekantieren beim Verlassen des Bündels in die Flasche.</li>
		<li>100 mL 2 % Natriumhypochlorit zugeben und 10 Minuten sanft köcheln.</li>
		<li>Entfernen Sie die Natriumhypochlorit-Lösung durch Dekantieren beim Verlassen des Bündels in die Flasche.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5-1.2.6.</li>
		<li>100 mL sterilen Reinstwasser hinzufügen und 1 min. köcheln.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.2.8 3 Mal auf Erhöhung der Spülung Zeit für jedes spülen (5, 10 und 15 min).</li>
		<li>Festen ½ MS Medium warm, Gießen Sie sie in eine sterile Pflanze-Kultur-Box bis zu einer Höhe von 2 cm und abkühlen lassen bis zum erstarren.</li>
		<li>Zart legen Sie jeder Samen auf festem Medium mit sterilen Pinzette.</li>
		<li>Schließen Sie das steril.</li>
		<li>Übertragen Sie die Box zu einer Kammer, Wachstum bei 22 ° C mit einer Photoperiode von 16 h/8 h Tag/Nacht und Flachs Sämlinge für 2 Wochen zu wachsen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metabolische Einbeziehung der Chemie Reporter
Hinweis: Drei experimentelle Modelle sind nachstehend: i) metabolische Kennzeichnung von Stammzellen Querschnitte, Ii) ganze Stengel und (Iii) Pflanzensämlinge. Jedes Protokoll ist für eine biologische replizieren vorgestellt und Mengen lässt sich die Anzahl der erforderlichen biologischen Replikationen anpassen. Monolignol Lösungen sind aus Stammlösungen hergestellt, die vorgenommen werden, wie in Tabelle 2 vor dem Experiment beschrieben. Die Stammlösungen können mehrere Monate bei-20 ° c gelagert werden Die HAZ: GALK oder H:G Proportionen können angepasst werden, um alle experimentellen Sonderanfertigungen passen.
<ol><li>Chemie Reporter Einbindung in 2 Monate alten Flachs Stamm Querschnitte
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 300 µL Chemie Reporter Lösung mit 10 µM GALK und 10 µM von HAZ in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK Lösung und überträgt es auf einen Brunnen einer 48-Well-Platte mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 300 µL Negativkontrolle Lösung mit 10 µM g und 10 µM von H in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Wirbel der H/G -Lösung und auf einen zweiten Brunnen von den gleichen 48-Well-Platte übertragen.</li>
		<li>Schneiden Sie den Stiel eines 2 Monate alten Flachs-Pflanze 10 cm über dem Boden mit einer neuen Rasierklinge.</li>
		<li>Bereiten Sie zart 50 Freihand transversalen Querschnitte des Stammes mit der Rasierklinge (ca. 150-250 µm dick).</li>
		<li>Die Querschnitte sofort in sterile ½ MS Flüssigmedium in einem Uhrglas statt.</li>
		<li>Sichtprüfung und wählen Sie erhalten ganze Querschnitte und zufällig verteilen 10 davon in der gut gefüllten mit HAZ/GALK -Lösung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.1.8 für den gut gefüllten mit H/G Lösung (als Negativkontrolle).</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.1.8 ein Drittel gut gefüllt mit 300 µL ½ MS Medium (als Hintergrund Drehregler zum Einstellen der Fluoreszenz-Baseline während der Weiterverarbeitung der Daten der konfokalen Mikroskopie Bilder).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte in Dauerlicht in einer Kammer Wachstum bei 20 ° C für 20 h.</li>
		<li>Entfernen Sie die Monolignol-Lösung in jedem Bohrloch mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Jedes gut 500 µL ½ MS Medium hinzufügen, 10 Minuten sanft köcheln und entfernen Sie diese Lösung mit einer Mikropipette spülen. 4 Mal wiederholen und weiter zum Glück sofort beschriften (Abschnitt 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Chemie Reporter Einbindung in 2 Monate alten Flachs ganze Stiele
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 5 mL-Chemie Reporter-Lösung mit 10 µM GALK und 10 µM von HAZ in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK Lösung und Transfer zu einer 20 cm hohen Glas-Test tube mit einer Pipette.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 5 mL Negativkontrolle Lösung mit 10 µM g und 10 µM von H in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Wirbel der H/G -Lösung und Transfer zu einer 20 cm hohen Glas-Test tube.</li>
		<li>Bereiten Sie eine dritte Reagenzglas mit 5 mL Medium ½ MS (als Hintergrund Drehregler zum Einstellen der Fluoreszenz-Baseline während der Weiterverarbeitung der Daten der konfokalen Mikroskopie Bilder).</li>
		<li>Schneiden Sie den Stiel eines 2 Monate alten Flachs-Pflanze 10 cm über dem Boden mit einer neuen Rasierklinge. Das Wurzelsystem und unteren Teil des Stammes wegschütten und fahren Sie fort mit dem nächsten Schritt mit dem oberen Teil der Pflanzenstängel.</li>
		<li>Tauchen Sie die Basis des ganzen Schnitt Stammes in das Röhrchen mit dem HAZ/GALK -Lösung. Legen Sie den Stamm in die Inkubation Lösung unmittelbar nach Entnahme des Wurzelsystems um es vor dem Austrocknen zu verhindern. Hinweis: Wenn die Methode auf jüngere/ältere Pflanzen und/oder andere Arten angewendet wird, die Lautstärke von Monolignol Lösungen muss eingestellt werden je nach Größe / Alter der Pflanze und der Durchmesser der seinen Stamm.</li>
		<li>Legen Sie den Stamm auf einer vertikalen Stütze, es gerade zu halten.</li>
		<li>Versiegeln Sie das Glasrohr mit Parafilm Verdampfung der Lösung zu vermeiden.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6-2.2.9 für die negativ-Kontrolle-Probe mit dem H/G -Lösung.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6-2.2.9 für die Fluoreszenz Hintergrund Kontrollprobe mit ½ MS Medium.</li>
		<li>Inkubieren Sie jeder Stamm für 20 h im Dauerlicht mit einer Neon-Licht.</li>
		<li>Nach 20 Uhr metabolische Gründungsurkunde, entfernen Sie den Stiel in der HAZinkubiert /GALK Lösung und spülen Sie ihn mit ½ MS Medium.</li>
		<li>Geschnitten Sie und verwerfen Sie unten 1 cm des Stiels mit einer Rasierklinge zu und dann bereiten Sie einen 1 cm hohen Zylinder von der Basis des restlichen Stammes.</li>
		<li>Sorgfältig bereiten Sie 20 Freihand transversalen Querschnitte (ca. 150-250 µm dick) aus dieser Zylinder und legen Sie sie sofort in einem Uhrglas mit ½ MS Medium gefüllt.</li>
		<li>Setzen Sie 500 µL ½ MS Medium in einem Brunnen der 48-Well-Platte.</li>
		<li>Sichtprüfung und wählen Sie intakt ganze Querschnitte und 10 von ihnen in den Brunnen gefüllt mit ½ MS Lösung zufällig zu verteilen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.13-2.2.17 für die Negativkontrolle Schaft mit H/G Lösung inkubiert.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.13-2.2.17 für die Fluoreszenz Hintergrund Kontrolle Schaft mit ½ MS Medium inkubiert.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Lösung in jedem Bohrloch mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Jedes gut 500 µL ½ MS Medium hinzufügen, 10 Minuten sanft köcheln und entfernen Sie diese Lösung mit einer Mikropipette spülen. 4 Mal wiederholen und weiter zum Glück sofort beschriften (Abschnitt 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Einbindung der Chemie Reporter in 2 Wochen alten Flachs Sämlinge Hinweis: Die folgenden Schritte sind alle unter sterilen Bedingungen durchgeführt.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 2 mL Chemie Reporter Lösung mit 10 µM GALK und 10 µM von HAZ in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK Lösung und Transfer zu einer 20 cm hohen Glas-Test tube mit einer Pipette.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 2 mL Negativkontrolle Lösung mit 10 µM g und 10 µM von H in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Wirbel der H/G -Lösung und Transfer zu einer 20 cm hohen Glas-Test tube.</li>
		<li>Bereiten Sie eine dritte 20 cm hohen Reagenzglas mit 2 mL ½ MS Medium (als Hintergrund Drehregler zum Einstellen der Fluoreszenz-Baseline während der Weiterverarbeitung der Daten der konfokalen Mikroskopie Bilder).</li>
		<li>Zart einen 2 Wochen alten Flachs Sämling aus der festen ½ MS Medium mit einer langen Pinzette entfernen (Abschnitt 1.2. oben).</li>
		<li>Den Keimling sanft auf das Röhrchen mit der HAZübertragen /GALK Lösung, um sicherzustellen, dass seine Wurzeln in die Lösung eingetaucht werden.</li>
		<li>Schließen Sie das Glasrohr mit einer Kunststoffkappe um Verdunstung zu vermeiden.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 für die Negativkontrolle Röhre mit dem H / G-Lösung.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 für die Fluoreszenz Hintergrund Steuerrohr mit ½ MS Medium.</li>
		<li>Inkubieren Sie jeder Sämling in Dauerlicht in einer Kammer Wachstum 20 h bei 20 ° C.</li>
		<li>Zart entfernen den Keimling in der HAZinkubiert /GALK Lösung und spülen Sie ihn mit ½ MS Medium.</li>
		<li>Bereiten Sie zart 20 Freihand Querschnitte (ca. 150-250 µm Dicke) der Keimachse.</li>
		<li>Setzen Sie 500 µL ½ MS Medium in einem Brunnen der 48-Well-Platte.</li>
		<li>Sichtprüfung und wählen Sie intakt ganze Querschnitte und 10 von ihnen in den Brunnen gefüllt mit ½ MS Lösung zufällig zu verteilen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.12-2.3.15 für die Negativkontrolle Sämling mit H/G Lösung inkubiert.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.12-2.3.15 für die Fluoreszenz Hintergrund Kontrolle Sämling mit ½ MS Medium inkubiert.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Lösung in jedem Bohrloch mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Jedes gut 500 µL ½ MS Medium hinzufügen, 10 Minuten sanft köcheln und entfernen Sie diese Lösung mit einer Mikropipette spülen. 4 Mal wiederholen und weiter zum Glück sofort beschriften (Abschnitt 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. dual Fluoreszenz Kennzeichnung von Pflanzenproben Querschnitt durch SPAAC und CuAAC
Hinweis: Die Seligkeit Kennzeichnung Protokoll ist identisch für alle 3 experimentelle Modelle (Abschnitt 2).
<ol><li>
Stamm-gefördert Kennzeichnung Azid-Alkinen Cycloaddition (SPAAC)
	<ol>
<li>Bereiten Sie 1 mL einer SPAAC Lösung mit 5 µM DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 in sterilen ½ MS Flüssigmedium. Wirbel die Lösung und im Dunkeln halten.</li>
		<li>Nach dem letzten Waschen Schritte des metabolischen Einbeziehung Protokolls [2.1.13, 2.2.21 oder 2.3.19 je nach der gewählten Versuchsanordnung], entfernen das ½ MS Medium und 300 µL der SPAAC Lösung pro Bohrloch mit einer Mikropipette.</li>
		<li>48-Well-Platte vor Licht zu schützen, durch abdecken mit Alufolie oder indem man sie in eine Box.</li>
		<li>Rühren Sie die Platte leicht auf einem mechanischen Schüttler für 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kupfer-katalysierte Kennzeichnung Azid-Alkinen Cycloaddition (CuAAC)
	<ol>
<li>Waschen Sie jeweils gut 4 mal wie beschrieben im Schritt 2.1.13 unter Beibehaltung der Plattenrandes im Dunkeln.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mL einer CuAAC Lösung mit 2,5 mM Natrium Ascorbat, 0,5 mM CuSO4 und 5 µM 5-TAMRA-PEG3-Azid in sterilen ½ MS Flüssigmedium. Wirbel die Lösung und im Dunkeln halten. Hinweis: Diese CuAAC Lösung muss vor Gebrauch frisch vorbereitet werden und kann nicht mehr als ein paar Tage bei 4 ° c gelagert werden</li>
		<li>Entfernen Sie das ½ MS Medium in jedem Bohrloch zu und fügen Sie direkt 300 µL der CuAAC Lösung pro nun mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Rühren Sie die Platte leicht auf einem mechanischen Schüttler für 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die CuAAC-Lösung mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Mit einer Mikropipette, fügen Sie ½ MS 500 µL, im Dunkeln für 10 min rühren Sie, dann entfernen Sie diese Waschlösung. Zweimal wiederholen.</li>
		<li>500 µL einer 7:3-MeOH/Wasser-Lösung hinzufügen, rühren in der Dunkelheit für 1 h dann entfernen Sie die Lösung Achtung: Methanol ist giftig durch Hautkontakt oder einatmen, und bezeichnet man als menschliches Karzinogen. Die Nutzung erfordert chemischen Rauch Hauben und Handschuhe.</li>
		<li>Fügen Sie ½ MS 500 µL, in der Dunkelheit für 10 min rühren Sie, dann entfernen Sie die Lösung. Wiederholen Sie 4 Mal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Montage der Proben auf Mikroskop gleitet
<ol><li>Platz 5 Tropfen Eindeckmittel auf einen Glas-Objektträger.</li>
	<li>Hinterlegen sorgfältig jede HAZ/GALKQuerschnitt auf der Folie markiert.</li>
	<li>Nagellack auf zwei gegenüberliegenden Seiten der Folie auftragen.</li>
	<li>Decken Sie die Folie mit einem Deckgläschen. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Eindeckmittel mit einem Papiertuch.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Probe mit Nagellack auf allen 4 Seiten. Lassen Sie den Nagel Lack trocken bei Raumtemperatur (ca. 30 min).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.6 für die Negativkontrolle H/G Querschnitte.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.6 für die Fluoreszenz-Hintergrund-Kontrolle-Querschnitte.</li>
	<li>Lagern Sie die Folien bei 4 ° C bis zur Beobachtung unter einem confocal Mikroskop im Dunkeln. Hinweis: Unterschiedliche Musterpräparate können für mehrere Wochen bis zu mehreren Monaten, abhängig von der Qualität der Zubereitung gespeichert werden. Wenn eine neue Beobachtung soll erfolgen nach Lagerung, sicherzustellen, dass die Proben nicht ausgetrocknet.</li>
</ol>5. die Bilderfassung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie
<ol><li>Schalten Sie alle benötigten Einheiten des Systems der konfokalen Mikroskopie in der richtigen Reihenfolge gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Wählen Sie das gewünschte Ziel mit maximaler numerischer Apertur und Anregung und Emission Wellenlängen angepasst (z.B. obj 60 X, N.A. 1.2. Autofluoreszenz Kanal: λex 405 nm, λEm 450 nm 25; SPAAC HAZ Kanal: λex 488 nm, λEm 525 nm 25; CuAAC GALK Kanal: λex 561 nm, λEm 595 nm 25; sequenziellen Modus).</li>
	<li>Wählen Sie die gewünschten Parameter für die Generierung von Bildern in der Software (12 oder 16-Bit erforderlich, Pixelgröße angepasst an das Nyquist-Kriterium).</li>
	<li>Legen Sie die Folie HAZ/gALK auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie die Probe unter der Objektivlinse.</li>
	<li>Beobachten Sie und finden Sie die gewünschte Region von Pflanzengewebe.</li>
	<li>
Erwerben Sie qualitativ hochwertige konfokale Bilder von doppelt beschriftete HAZ/gALK Probe.
	<ol>
<li>Wählen Sie die am meisten fluoreszierende Ebene in der z-Achse.</li>
		<li>Stellen Sie zu gewinnen, Offset und Laser macht, optimale Signalverteilung entlang der gesamten grauen Pegelbereich für jeden Kanal (Autofluoreszenz, HAZ und GALK) zu erreichen. Die gleichen Parameter müssen alle folgenden Akquisitionen beantragt werden.</li>
		<li>Den Erwerb des ausgewählten Bilds zu starten und die Datei speichern. Wiederholen Sie für jeden relevanten Bereich der Probe. Hinweis: 3D-Rekonstruktionen Z-Stapel können auch bei Bedarf erworben werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit den gleichen Einstellungen, erwerben Sie Bilder untagged Probe nur in ½ MS die Autofluoreszenz bestimmen (Fluoreszenz Hintergrundkontrolle wie in Abschnitt 2 beschrieben) inkubiert.</li>
	<li>Mit den gleichen Einstellungen, Abrufen von Bildern für die Negativkontrolle Proben inkubiert mit nativen Monolignols H/G unspezifische Fluorophor Haftung auf die Probe zu bestimmen.</li>
	<li>Datenverarbeitung auf die erworbenen Bilder zu subtrahieren Hintergrund Autofluoreszenz Signale in H/G Negativkontrolle Bilder und HAZ/gALK Bilder anwenden.</li>
</ol>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+(Linum+usitatissimum)+fibers+and+shives.">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li><li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems.">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li><li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition.">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li><li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolignol+glucosides+as+intermediate+compounds+in+lignin+biosynthesis.+Revisiting+the+cell+wall+lignification+and+new+13C-tracer+experiments+with+Ginkgo+biloba+and+Magnolia+liliiflora.">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Wie bereits erwähnt ist das duale Kennzeichnung BLISS Protokoll in diesem Papier präsentiert eines der ersten Beispiele für eine SPAAC/CuAAC Kombination in Vivo12,23. Jeder Schritt wurde gründlich optimiert und validiert, und es ist sehr wichtig, dass die Reihenfolge, in der die beiden klicken Chemie Kennzeichnung Reaktionen werden sequentiell durchgeführt, eingehalten wird (d. h. SPAAC zuerst, gefolgt von CuAAC). Alle Kreuz-Kontrollen haben gezeigt, dass jede Kennzeichnung Schritt spezifisch ist, wenn das BLISS-Protokoll angewandte23 ist : Durchführung der SPAAC Schritt führt zunächst zu hoch chemische Kennzeichnung HAZ -Azid Funktionen durch die Cyclooctyne funktionalisiert Fluorophor durch Reaktion mit schnellen Kinetik [3 + 2] Cycloaddition. Nachdem HAZ Einheiten markiert sind, kann der CuAAC Schritt erfordern copper(I) katalysiert Aktivierung von GALK terminal Alkinen Generierung von Triazol Links durch Reaktion mit der Azid-Fluor-545-Sonde erfolgen. Im Gegensatz dazu der umgekehrten Reihenfolge (d. h. CuAAC zuerst, gefolgt von SPAAC) sollte nicht verwendet werden, da sie zu GALK und HAZ Einheit führt Kreuz-Kupplung, die konkurriert mit Fluorophor Ligatur und führt zu einen dramatischen Verlust des Signals . Es ist auch wichtig zu betonen die Notwendigkeit, die zwischengeschalteten Waschschritten unspezifische Färbung zu vermeiden.
Wir haben gezeigt, dass unsere Methode auf verschiedenen biologischen Experiment Designs angewendet werden kann. Die Glückseligkeit Kennzeichnung Protokoll war zunächst auf Freihand Querschnitte der Flachs Stämme (ca. 150-250 µm dick) aufgetragen, die zuvor schneiden und mit der Klick-Ready Monolignols inkubiert wurden. Obwohl diese Konstruktion den Vorteil, die benötigten Mengen an Chemie Reporter hat (wie Inkubation Volumen reduziert werden) zu minimieren und die Produktion von statistischen Wiederholungen zu erleichtern, ist es nicht, streng genommen, eine in Vivo -System und in einigen Fällen können nicht alle Aspekte der real räumlich-zeitliche Lignification Dynamik wider. In einer zweiten experimentellen Design passten wir daher das BLISS-Protokoll an eine Methode, die zuvor verwendet wurde, um die Aufnahme der radioaktiven Monolignols im Kiefer und Gingko27zu studieren. Bei diesem Ansatz die Wurzeln und Stängel der Pflanze sind räumlich getrennt und die Basis des ganzen Stammes wird in der Monolignol Lösung in was "Blumenvase" Ansatz genannt werden kann inkubiert. Nach dem Ausscheiden aus den Stielen der gewünschten (Inkubationszeit), werden Querschnitte geschnitten und das BLISS-Protokoll durchgeführt. Dies erlaubt uns zu zeigen, (i) dass die geänderten Monolignols durch den lebenden Stamm transportiert werden und fließen in den wachsenden Polymere Lignin in den Zellwänden und (Ii), dass die Lokalisierung Muster im Wesentlichen identisch mit dem des Querschnitts Ansatz. Diese Art von Experiment hat das Verdienst, in eine echte lebende Pflanze durchgeführt / live Zelle nähern, so dass mehr Experimente und mehr eingehende Studien, erfordert aber größere Mengen an Chemie Reporter. Schließlich diente das BLISS-Protokoll auch mit Flachs-Pflanze-Sämlinge, vertritt eine echte Streckenmodell, in denen der Chemie Reporter durch die Wurzeln aufgenommen werden müssen vor dem Transport, des Stamms, lebt. Während dieses Modell hat den klaren Vorteil in lebenden Pflanzen, in der Praxis durchgeführt wird es beschränkt sich auf Jungpflanzen und eignet sich nicht wirklich für die Untersuchung von Lignification Dynamik in Altanlagen aus praktischen Gründen (lange Inkubationszeit, erhöhte Menge der Chemie Reporter). Dennoch, diese drei Experiment Designs ergänzen und alle haben ihre vor- und Nachteile im Hinblick auf die praktischen Aspekte und biologische Bedeutung abhängig von der biologischen Frage beantwortet werden.
Entwickelt, um die Lignification Dynamik im Flachs zu studieren, unser Protokoll ist sehr anpassungsfähig, nicht nur in Bezug auf biologische Experiment Design, sondern auch im Hinblick auf seine Anwendung auf andere Pflanzen Arten und Organe/Gewebe. BLISS kann beispielsweise leicht übertragen werden, der Arabidopsis oder die Populus-Gattungen, die besser geeignet, um Studien mit Knock Out "oder" Knock-Down durch Mutation entstehende Variationen für verschiedene Gene sind. Im Prinzip können doppelte Kennzeichnung Studien mit unserem Ansatz auch auf andere Biomoleküle erweitert werden mithilfe von zwei verschiedene modifizierten Vorstufen der pflanzlichen Zellwand Polymere - einschließlich aller drei wichtigsten Monolignols oder ihre metabolische Vorläufer sowie diverse Monosaccharide, die die Polysaccharid-Matrix darstellen. Seit seiner Gründung wurde Bioorthogonal Chemie in der Tat hauptsächlich entwickelt, um Glykane/Polysaccharide durch metabolische Oligosaccharid engineering (MOE)4,5,17,28zu untersuchen, aber überraschenderweise gab es nur sehr wenige Anwendungen, Biologie Pflanzen bisher7,8,9,10,11,12. Im Hinblick auf die Kompatibilität der Reaktionen war die Studie von Lignin in der Tat einem komplexen Fall zu lösen, da beide chemischen Reporter in der gleichen netzförmigen Polymer eingearbeitet werden. Die Möglichkeit der unbeschrifteten HAZ- warGALK Querverbindung entsteht Bildung das Hauptproblem, aufgrund der räumlichen Nähe der GALK und HAZ Einheiten innerhalb der 3D zu überwinden Struktur von Lignin23, eine Einschränkung, die möglicherweise nicht vorhanden, wenn die beiden chemischen Reporter nicht einbezogen werden in die gleiche Art von Biopolymer oder in der gleichen räumlichen Region einer bestimmten Zelle.
In größerem Umfang konnte die BLISS-Methodik im Wesentlichen auf eine Zweifarben-Fluoreszenz imaging Studie in Bakterien oder tierischen Modellen, die mit zwei unterschiedlichen chemischen Reporter trägt ein Azid und terminal Alkinen Tag, bzw. angewendet werden.

In den letzten zwei Jahrzehnten entstanden die Chemie Reporter-Strategie als eine leistungsstarke zweistufige Methodik, die Dynamik und die Funktionen der nicht genetisch codierte Biomoleküle zu untersuchen. 1 , 2 , 3 in dieser Strategie ein synthetisches Analogon das Biomolekül von Interesse mit einer kleinen Modulation – der Chemie Reporter – ist zunächst metabolisiert des lebenden Organismus, und dann eine chemische Sonde (zB., ein Fluorophor für Fluoreszenz konfokale Mikroskopie-Tomographie) ist der eingebaute Reporter über Bioorthogonal Click Chemie kovalent verbunden. Die Sonde muss rasch und gezielt reagieren mit der eingeführten chemische Modifikation während inert gegenüber jedem Biomoleküle im lebenden System vorhanden. Diese Methode überwindet in vielerlei Hinsicht die Grenzen der gemeinsamen Biokonjugaten Techniken durch den Einsatz von hochspezifischen Klick Chemie man damit die Möglichkeit zu verfolgen, Metaboliten oder Biomakromoleküle, die zuvor nicht zugänglich waren in lebenden Systemen4,5,6.
Trotz der schnell wachsenden Popularität dieser mächtigen Methode in bakterielle und tierischen Zellen sind Berichte über den Einsatz in Pflanzenbiologie überraschend wenige und weit zwischen7,8,9,10, 11,12. Wir interessierten uns vor allem bei der Anwendung dieser Strategie in Pflanzen, die Bildung von Lignin, eines der am weitesten verbreiteten Biopolymere auf dem Planeten und ein wichtiger Bestandteil von Lignozellulose Biomasse zu studieren. 13 , 14 Lignin ist ein phenolischen Polymer, das spielt eine wichtige strukturelle und schützende Rolle in der Entwicklung und Leben der höheren Pflanzen.
Es besteht im Allgemeinen aus drei 4-Hydroxyphenylpropanoid Moieties: H (p- Hydroxyphenyl), G (Guaiacyl) und S (Syringyl) Einheiten bzw. abgeleitet von drei "Monolignols" (p- Coumaryl, Coniferyl und Sinapyl Alkohole) sind über den Phenylpropanoid Weg im Zytoplasma der Zelle (Abbildung 1) synthetisiert. Nach dem Export in der Zellwand, Monolignols oxidiert sind radikale durch Peroxidasen oder Laccases nach dem durchlaufen sie rein chemischen radikalen Kupplungsreaktionen Lignin Polymere polymerisieren, bezeichnet ein Prozess Lignification. 15 , 16 obwohl Lignine stark beeinflussen die industrielle Verwertung vieler pflanzlicher Produkte, die wissenschaftliche Gemeinschaft hat noch einen langen Weg zu gehen, um die komplizierten Mechanismen Lignification zu entschlüsseln.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> Abbildung 1: der Lignification-Prozess in Pflanzenzellen. Monolignols sind Biosynthesized aus Phenylalanin in der Zellflüssigkeit. Nach dem Export in der Zellwand, Monolignols oxidiert sind radikale durch Peroxidasen oder Laccases nach dem durchlaufen sie rein chemischen radikalen Kupplungsreaktionen Lignin Polymere polymerisieren, bezeichnet ein Prozess Lignification. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Obwohl Berichte über den Einsatz von Bioorthogonal Reaktionen Glycan Analyse zahlreich sind, sind2,3,17 ihre Anwendungsbeispiele auf andere Arten von Biomolekülen weniger. Die Verwendung der Bioorthogonal Chemie für Lignin Bioimaging Zwecke wurde erst vor kurzem erstmals von Tobimatsu Et al. 8 in Arabidopsis Thaliana über die Einbeziehung von Coniferyl Alkohol Surrogate in das Polymer Lignin informieren wo es bildet die G-Einheiten,8,9 so demonstriert die Machbarkeitsstudie, die Chemie Reporter Strategien gelten in diesem Zusammenhang. Die Verwendung von CuAAC wurde auch anhand eine unterschiedliche Coniferyl-Alkohol-Derivat ein paar Monate später von Bukowski Et Al. 9 jedoch Lignin enthält auch H und S Einheiten und ein tieferes Verständnis des Lignification Prozesses erfordert mehr wissen über wie alle die Monolignols in das Polymer einbezogen werden und welche Faktoren kann Einfluss auf seine Zusammensetzung. Neue Fortschritte in diesem Bereich ist heute abhängig von der Entwicklung von effizienten Methoden mehrere chemische Reporter in lebenden Systemen gleichzeitig verfolgen. Obwohl ein paar Artikel über Glykoproteinen in den letzten Jahren18,19,die Grundlagen haben bleibt20,21,22, doppelte Kennzeichnung Ansätze eine große Herausforderung dar Bioorthogonal Chemie. Wenn eine reproduzierbare Single-Beschriftung klicken Sie auf Protokoll ist schwer zu entwickeln, dann doppelte Kennzeichnung Ansätze, die die Optimierung im Tandem von zwei sich gegenseitig erfordern sind kompatibel Bioorthogonal Reaktionen auf zwei separaten chemischen Reporter noch schwieriger. Die wenigen Beispiele, die diesen Aspekt Pionier verwendet eine Kombination von Stamm-gefördert-Azid-Alkinen Cycloaddition (SPAAC) und Alken-kurz inverse elektronische Nachfrage Diels-Alder (DAInv) Reaktionen Glykoproteinen in tierischen Zellen zu studieren. Allerdings dachten wir, dass die Bioorthogonality der DAinv Reaktion nicht in dieser Anwendung aufgrund der strukturellen Merkmale des Lignins garantiert werden könnte (bestehend aus elektronenreichen substituierte Cinnamyl-Art Monomere, die mit Elektron-Armen reagieren können Dienes wie die kurz-Sonden verwendet im DAinv Reaktionen) und dass das unspezifische Kennzeichnung erzeugen kann. Darüber hinaus erfordert die DAInv Reaktion chemische Griffe, die synthetisch schwer zu Zugang, wie auch als sperrig und lipophilen erhöhen dadurch die Möglichkeit, dass die Rate der Aufnahme, Transport und/oder Lokalisierung der chemischen Industrie Reporter in Vivo können betroffen sein. Gelten wir als sei Letzteres besonders relevant bei einem Klick Chemie Ansatz für das Studium Lignification, wir entschieden eine andere Richtung und entwickelt eine Bioorthogonal Ligation Imaging sequentielle Strategie (Glückseligkeit) mit einem Kombination von Strain-Promoted Azid-Alkinen Cycloaddition (SPAAC) und Kupfer katalysierte Azid-Alkinen Cycloaddition (CuAAC) in-vivo. 23
Diese zwei Reaktionen sind in der Tat die zwei wichtigsten Bioorthogonal klicken Sie auf Reaktionen, die bisher verwendet wurden, und vor allem in der wenigen Beispiele des Lignins imaging, die wurden vor kurzem veröffentlicht. 8 , 9 unsere Doppelstrategie Kennzeichnung ermöglicht den Einsatz einer Azid glyko-auf einem Monolignol Reporter und ein terminal Alkinen andererseits zwei chemischen Griffe, die (i) Plattierung in Richtung biologisch relevante Strukturen und (Ii) sehr klein (Abbildung 2 ). Infolgedessen wird die Auswirkungen dieser synthetischen Modifikationen auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der das Biomolekül untersuchten minimiert, wodurch mögliche Diskrepanzen zwischen den natürlichen und unnatürlichen Monolignol Substraten in den Bereichen Verkehr und Metabolization Preise während der metabolische Aufnahme Schritt. Obwohl die Kombination von SPAAC und CuAAC auf den ersten Blick sehr intuitiv scheint, ist es nach unserer Kenntnis nur das zweite Beispiel doppelte Kennzeichnung mit dieser Strategie und die erste Anwendung auf Strukturen als Glykoproteinen. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> Abbildung 2: BLISS doppelte Kennzeichnung Strategie. Tagged Analoga von native H und G Monolignols sind chemische Reporter HAZ und GALK . Sie fließen zunächst in die wachsende Lignin Polymere der Zellwände durch exogene Fütterung (Schritt 1). Cyclooctyne - und Azid-funktionalisiert fluoreszierende Sonden werden dann nacheinander auf die eingebaute Reporter durch Bioorthogonal ligiert Chemie klicken: die SPAAC Reaktion (Schritt 2) ist hochspezifisch HAZ Einheiten und ist gefolgt von einer CuAAC Reaktion ( Schritt 3), das ist spezifisch GALK Einheiten (Schritt 3), so dass die konkrete Lokalisierung von beiden Reportern unabhängig voneinander in der gleichen Probe. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Wir erstens entwickelt und validiert das Azid-Tags Monolignol Reporter HAZ (Ersatz von p- Coumaryl Spiritus) und Vorläufer des Lignins H Einheiten und dann entwickelt der Glückseligkeit Kennzeichnung Doppelstrategie in dem dient es zusammen mit der zuvor berichtete Alkinen getaggt GALK,9 (Ersatz von Coniferyl Alkohol) und Vorläufer des Lignins G Einheiten. In diesem reproduzierbare Protokoll entwickelt und getestet in Flachs ist eine wirtschaftlich bedeutende Pflanzenarten, die dual metabolische Einbindung der HAZ und GALK in Lignin zuerst vor dem sequentiellen SPAAC/CuAAC erreicht. Kennzeichnung. Hier sind tagged HAZ Einheiten zunächst speziell über die SPAAC Ligatur der ein Cyclooctyne funktionalisiert Fluorophor, gefolgt von CuAAC-vermittelten Ligatur von zweiten fluoreszierende Sonden auf tagged GALK gekennzeichnet Einheiten. Diese Methode kann wurde verwendet, um die Dynamik von Lignification Prozessen in pflanzlichen Zellwänden zu untersuchen und angewandte in Vivo , Querschnitte, lebenden Stämme sowie Sämlinge von verschiedenen Pflanzenarten einzudämmen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% sodium hypochlorite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm high glass tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Schott glass bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/6-TAMRA-PEG3-Azide</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-AZ109-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheese cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compost containing clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coniferyl alcohol (G)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MFCD00002922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CLK-A127-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1,5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flax seeds (L. usitatissimum L.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G&#8482; Slide Mounting Medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF-Plant Climatics</td>
			<td></td>
			<td>For 2-week-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Angelantoni Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>For 2-month-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta plant culture box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 2-week-old seedling culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Coumaryl alcohol (H)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>FC145653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 2-month-old plants culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile clamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical support</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for liquid and solid &#189; MS medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4.H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA.2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine.HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine.HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

Lignin ist eines der am weitesten verbreiteten Biopolymere auf dem Planeten und ein wichtiger Bestandteil von Lignozellulose Biomasse. Dieser phenolischen Polymeren spielt eine wichtige strukturelle und schützende Rolle in die Entwicklung und das Leben der höheren Pflanzen. Obwohl die komplizierten Mechanismen Lignification Prozesse in Vivo stark die industrielle Verwertung vieler pflanzlicher Produkte auswirken, hat die wissenschaftliche Gemeinschaft noch einen langen Weg zu gehen, um sie zu entziffern. In einem einfachen drei-Stufen-Workflow ermöglicht das doppelte Kennzeichnung Protokoll enthaltenen Bioimaging Studien aktiv verholzenden Zonen von Pflanzengewebe. Der erste Schritt besteht in der metabolischen Gründung von zwei unabhängigen chemischen Reporter, Surrogate von zwei einheimischen Monolignols, die Anlass zu Lignin H und G-Einheiten. Nach Einarbeitung in die wachsenden Lignin Polymere ist jeder Reporter dann speziell mit eigenem fluoreszierende Sonde über eine sequentielle Kombination von Bioorthogonal SPAAC/CuAAC klicken Sie auf Reaktionen gekennzeichnet. In Kombination mit Lignin Autofluoreszenz, dieser Ansatz führt zu der Generation von dreifarbigen Lokalisierung Karten von Lignin in pflanzlichen Zellwänden durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie und präzise räumliche informiert über das Vorhandensein oder Fehlen von active Lignification Maschinen auf der Skala des pflanzlichen Geweben, Zellen und verschiedenen Zellwand Schichten.

Klicken Sie mithilfe des vorgestellten BLISS-Protokolls mit synthetischen Monolignol Analoga und Bioorthogonal Chemie, es ist möglich, die Dynamik des Lignification Prozesses in lebenden Pflanzen zu visualisieren. Im Gegensatz zu etablierten Techniken für Lignin zielt Visualisierung (z. B. histochemische Färbung, Immunolocalization oder Autofluoreszenz), das "Doppelklick" Protokoll ausschließlich das Lignin hergestellt de Novo bei der metabolischen Gründung treten Sie ein und unterscheidet es von der bereits vorhandenen Lignins der Probe mit Dreikanal-zelluläre Bildgebung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 3). H AZ-Einheiten werden erkannt, mit der Anregung und Emission Wellenlängen des DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110, die speziell auf Natriumazid Funktionen geklickt wird integriert HAZ Moleküle während der SPAAC-Schritt (λex 501 nm /λEm 526 nm, Grün-Kanal), während GALK-Einheiten sind ähnlich wie bei den charakteristischen Wellenlängen der Azidefluor 545-Sonde, die speziell auf die integrierte terminal Alkinen Tags der G geklickt wird erkannt ALK während der CuAAC-Schritt (λex 546 nm /λEm 565 nm, roten Kanal); der dritte Kanal entspricht bereits vorhandene Lignin, das erkannt wird mit seiner intrinsischen Autofluoreszenz bei 405 nm (Blaukanal). Dieser Ansatz führt zu der Generation von dreifarbigen Lokalisierung Karten von Lignin in pflanzlichen Zellwänden, die genaue räumliche über das Vorhandensein Auskunft oder Fehlen von aktiven Lignification Maschinen zwischen verschiedenen Geweben eines Organs (Abbildung 3A ), zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb der gleichen Gewebe (Abb. 3 b-C) und verschiedenen Wandschichten der gleichen Zelle (Abbildung 3D). In anderen Worten, erlaubt diese Methode uns zu markieren, und speziell die "aktiven" Lignification Websites (HAZ und GALK Kanäle) zu lokalisieren durch differenzieren von Zonen wo Lignin bei einer früheren gebildet wurde Bühne der Pflanzenentwicklung (Autofluoreszenz Kanal). Darüber hinaus die Empfindlichkeit der Technik wird drastisch verbessert, im Vergleich zu Autofluoreszenz, und viel kleinere Mengen von frisch synthetisierte Lignin können erkannt (Abb. 3 b).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> Abbildung 3: Imaging eingearbeitete Monolignol chemische Reporter in Flachs Stiele. (A) die Hälfte eines handgemachten transversale Abschnitts eines Flachs Stammes, rekonstruierte Bild. (B) Näheres zu den ersten Schichten des Xylem differenzieren. Links Panel: Lignin Autofluoreszenz (blau, 405 nm), mittleren Bereich: fusionierte Lignin Autofluoreszenz (blau) und HAZ Fluoreszenz (grün, 526 nm) Kanäle, Rechts: fusionierte Lignin Autofluoreszenz (blau) und GALK Fluoreszenz (rot, 565 nm) Kanäle. Der Pfeil zeigt die erste beschriftete Zellwand aus das Kambium illustrieren die erhöhte Empfindlichkeit der Glückseligkeit im Vergleich zu Autofluoreszenz. (C) Beschriftung in verschiedenen Zelle Arten von sekundären Xylem und (D) auf sekundäre Xylem Zellen zur Veranschaulichung der Kennzeichnung Variationen in verschiedenen Schichten der gleichen Zellwand hautnah. Links Panel: fusionierte Lignin Autofluoreszenz (blau) und HAZ Fluoreszenz (grün, 526 nm) Kanäle, mittleren Bereich: fusionierte Lignin Autofluoreszenz (blau) und GALK Fluoreszenz (rot, 565 nm) Kanäle, Recht Panel: Lignin Autofluoreszenz (blau), HAZ (grün) und GALK (rot) Fluoreszenz Kanäle zusammengeführt. HAZ und GALK Co Lokalisierung ist in gelb dargestellt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Chemie Reporter Strategien wie die hier vorgestellte Methode der Glückseligkeit oder die einzige Kennzeichnung Verfahren zuvor von Tobimatsu Et Al. veröffentlicht 8 können daher eine viel feinere Studie als bisher zugängliche Methoden wie Immuno- oder histochemische Färbung und sehr einfach zu implementieren. Zum Beispiel Abbildung 4 zeigt, dass die Signalintensität HAZ/GALK Einbau in Faser Tracheiden/Schiffe (FT) von der Flachs sekundäre Xylem ist sehr hoch in den ersten paar Zellwänden aus dem Kambium aber in älteren Zellen verringert schrittweise. Dieses Profil ist entgegengesetzt zu der die Autofluoreszenz und zeigt an, dass die maximale Lignification in den ersten zwei bis drei FT Zellschichten aus dem Kambium sehr schnell erreicht wird. Im Gegensatz dazu Strahl (R) Zellen erscheinen weiterhin Lignification zu viel späteren Phasen ihrer Entwicklung als HAZ/GALK Einbau ist viel beständiger in den Wänden aller Zellen aus dem Kambium, das Mark. Es ist nicht verwunderlich, dass FT und R Zelltypen kontrastierenden Lignification Dynamik, anzeigen, da dieser Zelltypen unterschiedliche biologische Rollen mit zugehörigen Unterschiede in ihrer Entwicklungs-Programm haben. FTs sind in der Tat länglichen Röhren, die Reifen und schnell sterben, lassen Toten leere Zellen mit dicken verholzten Mauern, die wesentliche Rollen in mechanische Abstützung und vertikalen Transport von Wasser und Mineralien, zu spielen, während die engen Reihen von R-Zellen, die zu komponieren das xylem Strahlen sind in ihrem Reifen und funktionellen Zustand ohne dicken verholzten Wände lebendig.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> Abbildung 4: zellspezifische Monolignol Reporter Einbindung in Flachs Xylem. Bright-Feld konfokalen Mikroskopie auf (A) Teil eines Freihand Querschnitts aus Flachs Stamm. Rosa (Ray Parenchymzellen, R) und gelb (Faser Tracheid Zellen, FT) Pfeile zeigen Vektoren aus der kambiale Zone auf dem Mark und gescannt für Lignin Autofluoreszenz bei 405 nm (B), HAZ Fluoreszenz bei 526 nm (C) und G ALK Fluoreszenz bei 565 nm (D). (E) Blick auf das sekundäre Xylem. Links Panel: Lignin Autofluoreszenz (blau), HAZ (grün) und GALK (rot) Fluoreszenz Kanäle zusammengeführt. HAZ und GALK Co Lokalisierung ist in gelb dargestellt. Rechts: Schematische Darstellung der sekundäre Xylem Struktur in den Flachs Stamm. V, Schiff; FT, Faser Tracheid; R, Ray Parenchym Zelle. Diese Zahl wurde von Lion Et Al. modifiziert 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von zwei unterschiedliche chemische Reporter, H und G-Einheiten mit zwei Bioorthogonal Reaktionen im BLISS Protokoll entsprechend weitere quantitative Ergebnisse erzielt werden. Multiplex Kennzeichnung Strategien wie BLISS weitere Erkenntnisse über die Kontrolle von Monolignol Einbeziehung Verhältnisse unter verschiedenen Bedingungen könnten und zur Entschlüsselung des schwer fassbaren Lignification Prozess beitragen könnte. Wenn die relativen Anteile der H, G und S Monolignols in Lignine in der Tat sehr unterschiedlich je nach Spezies, Gewebe, Alter oder Umweltbedingungen des Werks sind, werden die komplizierten Mechanismen, die diese Komposition Regeln noch nicht vollständig verstanden. Die doppelte Kennzeichnung Technologie stellt eine leistungsfähige Methode der Untersuchung einige der Parameter, die Lignin Zusammensetzung zu regulieren. Zum Beispiel unterschiedliche HAZ: GALK Verhältnis mit Wonne erlaubt uns zu zeigen, dass Lignin Zusammensetzung im sekundären Xylem Gewebe direkt abhängig von Monolignol Verfügbarkeit innerhalb der Zellwände, und nicht auf Peroxidase/Laccase Spezifität (Abbildung 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> Abbildung 5: Wirkung der Inkubation Flachs Stem Abschnitte mit unterschiedlichen prozentualen Verhältnis von HAZ und GALK. H-AZ: GALK% Verhältnisse über jeder Spalte Zahlen gegeben sind. Oben: zusammengeführt HAZ und GALK Kanäle. Unten: Histogramme, durchschnittliche Fluoreszenzintensität HAZ und GALK für die verschiedenen % Verhältnisse angibt. Werte werden als Mittelwert von der mittleren Fluoreszenzintensität in Graustufen ± SD Skala ausgedrückt bar = 100 µm. diese Zahl verändert wurde, vom Löwen Et Al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Flachs wird für seine Bastfasern (BF) angebaut, die zur Herstellung von Textilien, Luxus-Papiere oder umweltfreundliche Verbundwerkstoffe verwendet werden. Ein wichtiger Aspekt ihrer industriellen Verwertung ist, dass sie sehr niedrige Niveaus von Lignin in den Zellwänden enthalten sind charakterisiert durch eine extrem dicke S2/G sekundäre Ebene19,24. BLISS kann Lignification Dynamik Unterschiede zwischen den verschiedenen Schichten der gleichen Zellwand hervorheben. Abbildung 6A zeigt, dass HAZ und GALK Reporter Einarbeitung beschränken sich auf die Zelle Ecken und Mittellamelle/primäre Zellwand der einige aber nicht alle Bastfasern. Das völlige Fehlen von Lignification in die Dicke Bast sekundäre Zelle Wand Faserschicht auch bei Monolignol chemische Reporter exogen geliefert enthüllt, die ihren Hypolignified Zustand ergibt sich aus dem Fehlen einer molekularen Umgebung geeignet für enzymatisch vermittelten Oxidation und Einbeziehung der Monolignols in einer wachsenden Polymerkette und, dass es nicht nur durch die transkriptionelle Regulierung der Monolignol Biosynthese Gene wie bereits berichtet,25. Diese Beobachtung korreliert auch mit der Tatsache, dass Leinsamen Peroxidase, die Gene Up-in den äußeren Stamm Geweben des Flachs chemische lbf1 mutierten geregelt sind, die verholzten Bastfasern26besitzt.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> Abbildung 6: BLISS hebt Zellwand Unterkonstruktion oder Layer-spezifische Unterschiede. (A) linken: Hellfeld Bild eines Abschnitts Flachs Stamm. Der Kreis zeigt ein Faserbündel. Rechten Seite: Großaufnahme auf Bastfasern. Fusionierte HAZ und GALK Kanäle (mit und ohne Hellfeld) zeigen, dass Lignification beschränkt sich auf Zelle Ecken (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) und Mittellamelle/primäre Zellwand der einige Bastfasern. BF, Bast Faser; Par, Parenchym Zelle; M, Mittellamelle; P, primären Zellwand; S1, erste Schicht des sekundären Zellwand; S2/G, sekundäre Schicht/gallertartige Schicht von sekundären Zellwand. (B) 2D Scheibe und 3D-Rekonstruktion der konfokalen Z-Stapel-Zoom der Flachs Wurzelbereich Endodermis. Casparian-Streifen (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) nur zeigt Autofluoreszenz und keine HAZ oder GALK. Die damit verbundenen Fluorogramm zeigt eine GALK/hAZ Anti-Korrelation: hohe grüne Fluoreszenz ist im Zusammenhang mit niedrigen rotes Signal (Kortex) und umgekehrt (Endodermis). Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Schließlich bieten Zweifarben-Methodik auch wertvolle Informationen über den "Lignification Zustand" der Zellwand Teilstrukturen in verschiedenen Entwicklungsstadien und Pflanzenorganen anders als den Schaft. Beispielsweise zeichnet sich die Endodermis der Flachs Wurzeln durch die Existenz einer Casparian Band in die radiale und transversale Zellwände in den frühen Phasen der Entwicklung. Dieser Band der hydrophoben Biopolymer, gemacht von Suberin und/oder Lignin, verhindert, dass Wasser und gelöste Stoffe durch die Wurzel, aus der Eingabe passiv durch den Apoplast aufgegriffen und zwingt sie zum Durchlaufen der Plasmamembran über einen Symplastic Weg, damit einen Beitrag zur der selektive Aufnahme Kapazitäten von Pflanzenwurzeln. Bei Anwendung auf Flachs Wurzeln zeigte unsere Strategie, dass HAZ und GALK in den tangentialen Wänden der endodermische Zellen ebenso wie in Teilen der radialen Wände fließen wo befindet sich die Casparian-Band fehlt (Abbildung 6 b). Völlige Abwesenheit von Monolignol Reporter Einbindung in die Casparian-Band selbst zeigt jedoch, dass es in diesem Entwicklungsstadium reif ist, während die anderen Wände noch die Website weiter Biopolymer Ablagerung sind. Die rekonstruierte 3D-Ansicht eines Z-Stack bringt deutlich die Casparian Band ans Licht. Interessant ist, die Wände der einige kortikalen Zellen neben der Endodermis erwies auch in der Lage der Einbeziehung HAZ bevorzugt (dabei auf die Anwesenheit von Lignin/Suberin in den Flachs Wurzelrinde) aber nicht GALK. Co Lokalisierung Analyse zeigte eine Anti-Korrelation zwischen HAZ und GALK, die die Existenz von zellspezifische Wand Struktur/enzymatische Maschinerie in diesen zwei angrenzende Zelle Arten vorschlagen.
Zusätzliche Tabelle1: Vorbereitung der festen ½ MS Medium <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Zusätzliche Tabelle 2: Vorbereitung der Chemie Reporter Stammlösungen <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

BLISS, ein dual Kennzeichnung Protokoll zur Untersuchung Lignification Dynamik, wurde entwickelt. Mit synthetischen Monolignol klicken Sie Reporter und eine sequentielle Kombination aus SPAAC und CuAAC Bioorthogonal Reaktionen, diese Methode ebnet den Weg für eingehende Analyse der Faktoren, die die Biogenese der Lignine in Plantaregulieren.

Visualisierung von Lignification Dynamik in Anlagen mit Klicken Sie auf Chemie: doppelte Kennzeichnung ist Glückseligkeit!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

The overall goal of this dual labeling methodology is to observe actively lignifying zones of plant tissues. In this workflow, the chemical reporter strategy is applied using two distinct chemical reporters in a sequential combination of bio-orthogonal click chemistry reactions. This method can help decipher key questions in the plant biology field such as determining what factors regulate the spatial or temporal formation of lignin within plants and walls.The main advantage of this technique is that it exclusively targets the lignin that is produced during metabolic Incorporation. It differentiates it from any preexisting lignin in the sample. Although we originally developed this method to study lignification flags, it could be used with other species such as arabidopsis, poplar, or indeed any other plant that produces lignin.To present this technique we have Clemence Simon who's a PhD student working at the interface between chemistry and biology and who is using this technique to study lignification dynamics. First, prepare a 300 microliter chemical reporter solution containing ten micromuller of alkine-tagged G reporter. And ten micromuller of azide-tagged H reporter and liquid sterile 1/2 MS medium.Vortex the solution and transfer it to one well of a 48-well plate with a transfer pipette. Prepare a 300 microliter negative control solution containing ten micromuller of G and ten micromuller of H and liquid sterile 1/2 MS medium. Vortex the solution and transfer it to a second well of the same 48-well plate.Using a clean razor blade, cut the stem of a two month old flax plant at ten centimeters above soil level. Diligently prepare 50 free hand transversal cross sections of the stem using the razor blade and place them immediately in a 1/2 MS medium. Then, select intact, whole cross sections and randomly distribute ten of them in the well filled with the chemical reporter solution, taking care not to damage the tissue.The cross sections must be cut firmly and cleanly and the cross section has to be straight. You need a steady hand and a sharp razor blade in order to keep the tissues intact. It's advised to practice beforehand.After distributing ten intact cross sections in the negative control solution, incubate the plate in continuous light in a growth chamber at 20 degrees Celsius for 20 hours. On the following day, remove the monolignal solution in each well with a micropipette. Add 500 microliters of 1/2 MS medium to each well and stir gently for ten minutes.Then, remove the rinsing solution with a micropipette. Prepare one milliliter of a strain-promoted azide-alkine cycloaddition solution. Containing five micromuller of cyclooctene-tagged fluorescent dye and liquid sterile 1/2 MS medium.Then, vortex the solution. After the final washing steps of the metabolic incorporation protocol, remove the 1/2 MS medium and add 300 microliters of the SPAAC solution to each well with a micropipette. Shield the 48-well plate from light by placing it in a box.Then, gently stir the plate on a mechanical shaker for one hour in the dark at ambient temperature. Following this, wash each well four times with 1/2 MS medium as previously described, while keeping the plate in the dark. Prepare one milliliter of copper catalyzed azide alkine cycloaddition solution containing sodium ascorbate, copper sulfate, and azide-tagged fluorescent dye, and liquid sterile 1/2 MS medium.Then vortex the solution. After removing the 1/2 MS medium, place the plate in a box and add 300 microliters of the CuAAC solution to each well with a micropipette. Gently stir the plate on a mechanical shaker for one hour in the dark at ambient temperature.Remove the plate from the mechanical shaker and remove the CuAAC solution from each well with a micropipette. Then, add 500 microliters of 1/2 MS medium and stir the plate on the mechanical shaker for ten minutes in the dark. After washing two more times with 1/2 MS medium, add 500 microliters of a 7:3 methanol and water solution to each well.Stir the plate on the mechanical shaker for one hour in the dark. Then, remove the solution from the wells. Next, add 500 microliters of 1/2 MS medium to each well and stir in the dark for ten minutes.After repeating this wash four times, keep the cross sections stored in 1/2 MS medium, protected from light. Place five drops of mounting medium on a glass microscope slide. Then, carefully deposit each chemical reporter-tagged cross section on the slide.Apply nail polish on two opposite sides of the slide. Cover the slide with a cover slip, taking care to avoid air bubbles. Then, remove excess mounting medium using a paper towel.Following this, seal the sample with nail polish on all four sides. After the nail varnish is dry, store the slides at four degrees Celsius in the dark until observation under a confocal microscope. Plant sections have a tendency to get crisp when they dry.Make sure to always keep them in solution and to seal the cover slips with nail polish on all sides. It increases the shelf life of the mounted slides. Place the sample slide on the microscope stage under the objective lens.Observe and spin the sample to identify the desired region of the plant tissue. Next, select the most fluorescent plane in the Z-axis. Adjust the gain, offset, and laser power to achieve the optimal signal distribution along the whole gray level range for each channel.Finally, acquire high-quality confocal images. BLISS provides three color localization maps of lignin within plant cell walls, exclusively targets the lignin produced in novo during metabolic incorporation and differentiates it from the preexisting lignin in the sample. It highlights the active lignification sites within different tissues of an organ within different cell types of a tissue, or within different wall layers or substructures of a cell.The alkine-tagged G and azide-tagged H reporter incorporation profiles from the cambium to the pith within the flax secondary xylem indicate that maximum lignification is rapidly reached in fiber tracheids during development, whereas race cells continue to incorporate lignin at much later stages of their life. Varying the chemical reporter ratio demonstrates that lignin composition in secondary xylem tissues is directly dependent upon monolignal availability within the cell walls. Rather than on peroxidase or laccase specificity during lignin polymerization.Chemical reporter incorporation is limited to the cell corners and middle lamella primary cell wall of some, but not all bast fibers. In flax roots, the chemical reporters are incorporated in the walls of endodermal cells where the casparian band is absent. For better visualization of tissue architecture, 3D Z stack reconstructions can also be generated.Following this visual, comprehensive data processing can also be performed. All precautions taken, it is possible to obtain constant results by relative comparison, reading a sample between different samples. It can be done in addition to the localization of active leading of varying areas.This method is a wonderful tool for plant biologists like myself who study the cell wall. Once it's mastered, it can be done in a few hours. It's very sensitive and it can be applied to a whole range of different in vitro in vivo experimental model systems.Applying the chemical reporter strategy to lignin paves the way for chemical biologist to explore lignification dynamics and find out what controls this polymerization process, which in many respects, still constitutes uncharted territory.