A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Abstract
Genetics
Når steady state RNA niveauer sammenlignes mellem to betingelser, er det ikke muligt at skelne mellem om ændringer, der skyldes ændringer i produktionen eller nedbrydning af RNA. Denne protokol beskriver en metode til måling af RNA produktion, ved hjælp af 5-Bromouridine mærkning af RNA efterfulgt af immunoprecipitation, som giver mulighed for undersøgelse af RNA syntetiseret inden for en kort tidshorisont (fx, 1 h). Fordelen ved 5-Bromouridine-mærkning og immunoprecipitation over brugen af giftige transcriptional hæmmere, såsom α-amanitin og actinomycin D, er, at der er ingen eller meget lav effekter på celle levedygtighed under kortvarig brug. Men, fordi 5-Bromouridine-immunoprecipitation kun fanger RNA produceret inden for den korte tid, mærkning, langsomt produceret samt hurtigt nedbrudt RNA kan være vanskeligt at måle ved denne metode. Den 5-Bromouridine-mærket RNA fanget af 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseres ved reverse transkription, kvantitative polymerase kædereaktion og næste generation sequencing. Alle typer af RNA kan blive undersøgt, og metoden er ikke begrænset til måling mRNA, som præsenteres i dette eksempel.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved