Undersøgelse af RNA syntese ved hjælp af 5-Bromouridine mærkning og Immunoprecipitation

Når steady state RNA niveauer sammenlignes mellem to betingelser, er det ikke muligt at skelne mellem om ændringer, der skyldes ændringer i produktionen eller nedbrydning af RNA. Denne protokol beskriver en metode til måling af RNA produktion, ved hjælp af 5-Bromouridine mærkning af RNA efterfulgt af immunoprecipitation, som giver mulighed for undersøgelse af RNA syntetiseret inden for en kort tidshorisont (fx, 1 h). Fordelen ved 5-Bromouridine-mærkning og immunoprecipitation over brugen af giftige transcriptional hæmmere, såsom α-amanitin og actinomycin D, er, at der er ingen eller meget lav effekter på celle levedygtighed under kortvarig brug. Men, fordi 5-Bromouridine-immunoprecipitation kun fanger RNA produceret inden for den korte tid, mærkning, langsomt produceret samt hurtigt nedbrudt RNA kan være vanskeligt at måle ved denne metode. Den 5-Bromouridine-mærket RNA fanget af 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseres ved reverse transkription, kvantitative polymerase kædereaktion og næste generation sequencing. Alle typer af RNA kan blive undersøgt, og metoden er ikke begrænset til måling mRNA, som præsenteres i dette eksempel.