Undersøkelse av RNA syntese med 5-Bromouridine merking og Immunoprecipitation

Når steady state RNA nivåer sammenlignes mellom to betingelser, er det ikke mulig å skille om forandringer er forårsaket av endringer i produksjon eller degradering av. Denne protokollen beskriver en metode for måling av RNA produksjon, bruker 5-Bromouridine merking av RNA etterfulgt av immunoprecipitation, som gjør etterforskningen av RNA syntetisert innen kort tid (f.eks, 1 time). Fordelen av 5-Bromouridine-merking og immunoprecipitation over bruken av giftige transcriptional hemmere, som α-amanitin og actinomycin D, er at det er ingen eller svært lav effekt på cellen levedyktighet under kortvarig bruk. Men fordi 5-Bromouridine-immunoprecipitation bare fanger RNA produsert innen kort merking tiden, sakte produsert samt raskt forringes kan RNA være vanskelig å måle på denne måten. Den 5-Bromouridine-merket RNA fanget av 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseres av omvendt transkripsjon, kvantitativ polymerasekjedereaksjons og neste generasjons sekvensering. Alle typer RNA kan undersøkes og metoden er ikke begrenset til måle mRNA som presenteres i dette eksempelet.