Utredning av RNA-syntes med 5-Bromouridine märkning och Immunoprecipitation

När steady state RNA-nivåer jämförs mellan två villkor, är det inte möjligt att särskilja huruvida förändringar orsakas av förändringar i produktionen eller nedbrytning av RNA. Det här protokollet beskriver en metod för mätning av RNA produktion, med hjälp av 5-Bromouridine märkning av RNA följt av immunoprecipitation, som möjliggör undersökning av RNA syntetiseras inom en kort tidsram (t.ex., 1 h). Fördelen med 5-Bromouridine-märkning och immunoprecipitation över användningen av giftiga transkriptionell hämmare, såsom α-amanitin och actinomycin D, är att det finns ingen eller mycket låg effekt på cellernas viabilitet under kortvarig användning. Eftersom 5-Bromouridine-immunoprecipitation endast fångar RNA produceras inom den korta tid som märkning, långsamt produceras samt snabbt försämrad kan RNA dock svårt att mäta med denna metod. 5-Bromouridine-märkt RNA fångas av 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseras genom omvänd Transkription, kvantitativa polymeraskedjereaktion och nästa generations sekvensering. Alla typer av RNA kan utredas, och metoden är inte begränsad till att mäta mRNA som presenteras i detta exempel.