BioID 细胞环境中特异蛋白复合物的分离-蛋白质组学分析

Summary

我们提供了一步一步的协议为分裂-BioID, 一种蛋白质片段互补试验的基础上的接近标记技术 BioID。激活在两个给定的蛋白质的相互作用, 它允许蛋白质组学分析的上下文相关的蛋白质复合物在他们的本机细胞环境。该方法简单, 成本效益高, 只需要标准的实验室设备。

Abstract

为了补充现有的亲和纯化 (AP) 方法, 以确定蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI), 已经引入酶, 允许接近相关的标签蛋白质在活细胞。一种这种酶, 比拉 * (用于 BioID 方法), 介导蛋白质的 biotinylation 在大约10毫微米范围内。因此, 当融合到一个感兴趣的蛋白质, 并表达在细胞, 它允许标签的近端蛋白在其本土环境。与依赖于组装蛋白复合物纯化的 AP 相反, BioID 检测在细胞中被标记的蛋白质, 无论它们是否仍然与它们在分离时的兴趣蛋白相互作用。由于它 biotinylates 近端蛋白质, 你可以而且利用链亲和素的特殊亲和性, 以非常有效地分离它们。虽然 BioID 在识别瞬态或弱相互作用方面表现优于 ap, 但 ap 和 BioID 质谱方法都提供了一种已知蛋白质可能的相互作用的概述。但是, 它们不提供有关每个已确定 PPI 的上下文的信息。事实上, 大多数蛋白质通常是几个复合体的一部分, 对应于不同的成熟步骤或不同的功能单元。为了解决这两种方法的共同局限性, 我们设计了一种基于比拉酶的蛋白质片段互补试验。在这项试验中, 两个非活性片段的比拉 * 可以重组成一个活跃的酶, 当接近接近由两个相互作用的蛋白质, 他们被融合。由此产生的分裂-BioID 的检测, 从而允许标签的蛋白质, 聚集在一对相互作用的蛋白质。如果这两个仅在给定的上下文中进行交互, 则 BioID 将允许对其本地蜂窝环境中特定的上下文相关功能单元进行分析。在这里, 我们提供了一步一步的协议, 以测试和应用分裂 BioID 的一对相互作用的蛋白质。

Introduction

由于大多数细胞功能是由动态组装大分子络合物的蛋白质进行的, 蛋白质相互作用的鉴定是生物医学研究中的一项重要努力。事实上, PPI 在疾病中经常被解除管制, 并代表治疗¹的潜在目标。PPI 鉴别的最广泛使用的方法是亲和纯化 (AP) 方法, 在细胞裂解后, 一种感兴趣的蛋白质被专门纯化在基质上, 相关蛋白随后通过质谱鉴定(MS)。虽然 AP MS 是一个强有力的方法, 它通常不会表现良好的可溶性蛋白复合物, 非常短暂的相互作用或 PPI, 需要一个完整的亚细胞结构。而且, 由于 PPI 网络的动态特性, 对数据的解释可能会很复杂, 因为单个蛋白质通常是几个不同蛋白质复合体的一部分。

最近开发了接近标记技术, 如 BioID²或 APEX2^3、4 , 以解决 AP MS 方法的一些局限性。在 BioID, 酶比拉 * (对应于野生类型的大肠杆菌酶的 G115R 变种) 催化形成的不稳定的 biotinyl 安培 (生物放大器), 可以与初级胺反应。相对于野生型酶, 它保留生物安培在其活跃的中心, 比拉 * 释放生物放大器允许其扩散到其邻近的环境。因此, 当融合到一个感兴趣的蛋白质, 并表达在细胞, 近端蛋白可以生物素化在估计范围内 10^毫微米5。这些标记的近端蛋白质然后被链亲和素下拉和由 MS 辨认。与 AP MS 相反, BioID 需要融合蛋白的表达。因此, 它只能适用于功能不受标签限制的蛋白质。此外, 标签速度很慢, 通常 6–24 h^2,6, 使得检测短寿命蛋白质具有挑战性。然而, 与 AP ms 相比, BioID 提供了几个关键优势: 首先, 它捕捉到了其本地细胞环境中的相互作用;第二, 细胞裂解后分离出标记蛋白而非组装复合物;第三, 链亲和素 pulldowns 允许使用变性缓冲器和苛刻的洗涤条件。因此, 该方法对于检测瞬态或弱交互⁷或发生在特定和难以隔离亚细胞结构⁸上的交互更敏感。

然而, 大多数蛋白质通常是较大的复合体的一部分, 可以根据细胞的暗示或需要执行的功能进行改造。因此, 单个蛋白质通常是几个配合物的一部分, 对应于不同的功能单位, 涉及不同的和/或重叠的 PPI。这两种方法都概述了给定蛋白质可能具有的所有关联, 但它们未能解决单个 PPI 的上下文。为了增加后者的分辨率, 我们设计了一种蛋白质片段互补试验 (PCA), 其中两个不活跃的比拉 * (NBirA *, 包含催化领域, CBirA *, 可以被视为重新激活域) 可以当两种相互作用的蛋白质在接近的接近度时, 重新组装成活性酶⁹。由此产生的分裂-BioID 检测聚焦于接近依赖的 biotinylation 蛋白质, 聚集在一对相互作用的蛋白质, 从而允许识别上下文相关的蛋白质组件。最近, 我们通过解决 miRNA 介导的基因沉默通路⁹中的两个不同的蛋白质复合体, 证明了 BioID 的杰出分辨力。

总之, 在一个单一和简单的检测, 分裂-BioID 允许发现和具体分配 PPI 到定义的功能单位, 其中一个特定的蛋白质, 提供一个额外的互动蛋白的相应的蛋白质复合体已知。

Protocol

注意: 方法的概述显示在图 1上。

1. 克隆战略的规划

1. 选择两个认定相互作用的蛋白质进行测试。
   注意: 这两种蛋白质中的每一个都将被融合成一个分裂 BioID 片段: NBirA * 或 CBirA *。作为一个负控制, CBirA * 融合蛋白将测试与 NBirA * 融合到绿色荧光蛋白 (NBirA * GFP)。作为一个额外的控制, NBirA * 融合可以单独测试, 没有同源 CBirA * 融合或结合 CBirA * 融合到一个无关的蛋白质。最好不要使用 CBirA * GFP 作为负控制, 因为它被证明始终如一地导致主要背景, 当结合到任何 NBirA * 融合蛋白⁹。这种观察的原因可能是 CBirA 的表达水平, 远远高于任何其他 CBirA * 融合蛋白我们已经使用了, 这可能导致显著的 reassociation 与 NBirA * 片段。
2. 一旦选择了两种蛋白质, 检查文献以发现两者是否已经成功地标记在功能研究中 (例如, 作为 GFP 标记的融合蛋白)。
   1. 如果存在此类研究, 请记下标记的位置 (在 N 或 C 终点), 并使用相同的方向标记与 BioID 碎片有关的感兴趣的蛋白质。
   2. 如果不存在这样的研究, 计划构建在 N 和 C 终点标记的两种蛋白质的编码, 并计划一项测试, 以检测融合蛋白的功能 (例如, 在细胞线上的抢救实验, 耗尽的蛋白质)。
      注: 当配对两种融合蛋白时, 使用图 2中描述的质粒, 编码长柔连接器, 融合蛋白 (比拉) 的方向 (在感兴趣的蛋白质的上游或下游融合) 一般无关紧要。.事实上, 使用 FRB 和 FKBP 作为模型蛋白, 它表明, 所有四可能的迭代 (两个碎片在 n 总站, 无论是在 c 总站, 一个在 n 总站和其他 C 总站, 反之亦然) 产量可比 biotinylation⁹。
3. 设计底漆, 以放大码的两个感兴趣的蛋白质克隆成分裂-BioID 质粒。注意翻译框架与比拉的片段相同。如果使用图 2中描述的质粒, 则使用限制酶 PmeI 和 PacI 构造 CBirA * 融合, 以及 MluI * 融合的酶快和 NBirA。
   注:图 2中描述的质粒在 F3/FRT 重组点两侧带有双向响应的应答元素。这允许被调控的共同表达在大致相同水平的两种融合蛋白从同一质粒¹⁰, 并有可能通过重组介导的盒式交换 (RMCE) 快速构造稳定的细胞系。在这些质粒中, NBirA * 有一个 c-myc 标记, 而 CBirA * 有一个标志标记。当然, 码也可以用本构促进剂在单个质粒上克隆。
   关键步骤:在测试两种相互作用的蛋白质时, 建议将 NBirA * 融合到蛋白质1结合 CBirA * 融合到蛋白质 2, NBirA * 融合到蛋白质2结合 CBirA * 融合到蛋白质1。的确, 经常会发现一个迭代比另一种更有效。

2. 将感兴趣基因的码克隆成分裂-BioID 质粒

注: 在这个例子中, 两个可以被标记在 N 终点的蛋白质被考虑。将测试四条件, 并将其与未转染的单元格 (表 1) 进行比较。

1. 使用聚合酶链反应 (PCR) 放大码的两种蛋白质, 以适当的引物测试。设计引物, 介绍了 NBirA * 融合蛋白的快和 MluI 限制点, 以及 PmeI * 融合蛋白的 PacI 和 CBirA 点。
   注: PCR 可以进行任何商业, 优先校对, DNA 聚合酶。按照标准的协议, 从手册和适应它的熔化温度的底漆和长度的 ORF 将被放大根据制造商的指导方针。
2. 亚克隆第一个 ORF
   1. 消化两种质粒 (约2微克) 和 PCR 扩增 ORF1 (与 NBirA *) 快和 MluI。使用每种酶的 1 ul 进行消化反应, 在1.5 毫升管中与适当数量的 DNA 和反应缓冲剂混合, 在 20 ul 中的总容积为1小时, 37 摄氏度。
   2. 在1% 琼脂糖泰 DNA 凝胶上运行两种消化样品。用干净的手术刀将与所消化的质粒和 ORF1 相对应的带转移到1.5 毫升管。
   3. 使用标准的 DNA 提取试剂盒净化两个波段。
   4. 用标准试剂结扎消化质粒和 ORF1。
      1. 如果使用材料表中所示的结扎套件, 结扎100的 DNA 含有三至五次摩尔过量插入质粒, 总体积为 4.5 ul。添加 5 ul 2x T4 连接酶缓冲器和 0.5 ul 的 T4 DNA 连接酶从结扎试剂盒。在室温下 (RT) 在1.5 毫升管中进行结扎反应10分钟。
   5. 转换成标准 DH-5α大肠杆菌主管细胞 (根据井下的方法¹¹编写)。
      1. 混合 3 ul 的结扎反应与 50 ul 的主管细胞在1.5 毫升管冰和孵化30分钟. 将单元格转换为30-45 秒的42摄氏度, 然后在冰上孵化2分钟. 添加 250 ul 预预热 (37 °c)溶源性汤 (磅) 培养基和板 100 ul 的细胞在预热 (37 °c) 氨苄西林含 LB 琼脂板。在37摄氏度的夜间孵化细胞。
   6. 第二天, 选择四到六个殖民地和孵化他们在37°c, 180 rpm, 隔夜在3毫升的 LB 培养基含有100μg⋅mL^-1氨苄西林在15毫升管。
   7. 使用标准 DNA MiniPrep 试剂盒将所选菌落中的质粒分离出来。
   8. 使用卡带2反向底漆 (表 2) 验证该质粒的正确性。
3. 一旦发现含有第一个 ORF 的质粒, 亚克隆在该质粒中的第二个 orf 与步骤2.2 相同, 但使用 PmeI 和 PacI 酶。
4. 使用卡带1反向底漆 (表 2) 序列生成的质粒。

3. 融合蛋白的检测

注: 以下说明是为双诱导表达质粒 (图 2) 和 HeLa-11ht 细胞, subclonal HeLa-CCL2 细胞系, 稳定地表达反向四环素控制转录激活剂 rtTA-M2 和含有RMCE¹²的轨迹。这些细胞的生长培养基是 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM), 含有10% 无四环素的胎牛血清 (血清)。当使用另一种细胞类型, 确切的播种条件和生长培养基将需要适应。

1. 瞬变转染
   1. 种子细胞在浓度为 1 x 10⁵细胞在2毫升每井六个井板材在转染和孵化细胞隔夜在37°c, 5% CO₂在细胞培养孵化器的前一天。
   2. 在转染日, 除去每一个井的培养基, 并用2毫升的新鲜培养基替换。
   3. 根据表 1准备四转染反应。为每个井染, 添加6µg 聚乙烯亚胺到3µg 的质粒 DNA 在1.5 毫升无菌管和填充到500µL 与 DMEM 培养基没有血清。
   4. 在室温下将每个转染的混合体孵化至少5分钟, 然后再加滴明智的每一个井。在37摄氏度、5% CO₂上过夜孵化细胞。
2. 感应和接近标记
   1. 在转染后的一天, 去除培养基, 并替换为培养基补充与生物素在50µM, 以刺激 biotinylation 和强力霉肽在 200 ng⋅mL⁻¹ , 以诱导融合蛋白的表达。在37°c, 5% CO₂上孵化细胞至少20小时。
      1. 为了使生物素的库存解决方案, 将生物素分解为 50 mg⋅mL^-1 (对应于ca200 毫米) 在2米的氢氧化铵中。一旦它被完全溶解, 稀释它到50毫米在500毫米 Hepes, ph 7.4, 然后调整 ph 值到7.4 与 HCl. 整除并且存放结果1,000x 存货解答在-20 °c。溶解强力霉素在 10 mg⋅mL^-1在70% 乙醇和存储在螺钉帽微细在-20 °c 在黑暗中。
3. 细胞裂解制剂
   1. 用1毫升的冷 (4 °c) 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 清洗细胞。
   2. 对每个井, 增加100µL 溶解缓冲 (50 毫米三 pH 值 7.4, 150 毫米氯化钠, 2 毫米 EDTA, 0.5% NP-40, 0.5 毫米和蛋白酶抑制剂)。
   3. 用细胞刮刀和转移到1.5 毫升管来收割细胞。
   4. 离心样品在 1.4万 x g 10 分钟在4°c 去除细胞碎片。
   5. 把上清液转移到新鲜的管子上, 放在冰上。
   6. 用布拉德福德测定蛋白质量。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (页) 与西方印迹
   1. 准备一个 SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
   2. 对于每一个清除的裂解液, 准备一页样本30µg (至少15µg) 蛋白质总共30µL 的 SDS 加载缓冲区。然后在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上加载等量的每个样品 (20 µL/井), 然后进行电泳。
   3. 电泳后, 使用任何标准协议将分馏蛋白转化为低荧光 PVDF 印迹膜。
      注: 为分析蛋白质 biotinylation, 10 分钟的传输时间与 "高兆瓦" 程序的快速转移半干西方印迹装置通常工作良好。
   4. 转移后, 将5% 块干牛奶中的膜阻挡在 RT 中30分钟。
   5. 在 2% BSA 和 0.1% Tween-20 的 PBS 中, 用荧光链亲和素共轭稀释1:15,000 在 RT 中孵化30–60分钟的膜。
   6. 冲洗膜三次, 每10分钟, 与 pbs 含有 0.1% Tween-20, 然后再一次与 pbs。
   7. 在荧光扫描仪成像系统上扫描膜。
      注意: 典型的西方印迹显示在图 3上。上述过程描述了一种基于荧光的检测方法, 但使用链亲和素耦合的光检测技术也同样有效。

4. 蛋白质组学研究的分 BioID

关键注意事项:对于最终的质谱分析, 所有的步骤都要在无角蛋白的条件下进行, 所有的材料和试剂应该尽可能的无角蛋白。

1. 瞬变转染
   1. 在转染前的前一天, 种子三到四 10 cm 板材为每个条件在 8 x 10⁵细胞的集中在10毫升每板, 并且孵化细胞在37°c, 5% CO₂在细胞培养孵化器中过夜。
   2. 第二天, 为每个转染条件准备一个主转染组合: 每条件三个板块, 36 µg 聚乙烯亚胺, 18 µg 质粒 DNA 溶解于900µL 无血清 DMEM。在 RT 中孵化每个主混合至少5分钟。
   3. 同时, 用新鲜的培养基取代每道菜的培养基, 然后添加300µL 的转染混合物, 使每个盘子都更清爽。
   4. 在37摄氏度、5% CO₂上过夜孵化细胞。
2. 感应和接近标记
   1. 转染后的一天, 把细胞转移到15厘米的盘子里。每道菜, 取出培养基, 用7毫升 PBS 冲洗细胞, 加入1.5 毫升的胰蛋白酶-EDTA 溶液, 在 RT 中孵育5分钟. 添加3.5 毫升的生长培养基并用重悬细胞, 将细胞悬浮液转移到15厘米的盘子里, 填充20毫升的生长培养基。辅以生物素在50µM, 以刺激 biotinylation 和强力霉肽在 200 ng⋅mL⁻¹ (最终浓度), 以诱导融合蛋白的表达。
   2. 在37°c, 5% CO₂上孵化细胞至少20小时。
3. 细胞的收获和存贮
   1. 用 pbs 冲洗两次细胞, 然后在每个盘子中加入1.5 毫升的 pbs, 用刮刀来收割细胞。
   2. 将所收获的细胞与一个条件相对应, 转移到15毫升管中, 并通过离心 1200 x g、5分钟、4°c 来收获它们。
   3. 除去上清液和快速冷冻的颗粒在液氮, 然后存储在80°c, 直到进一步处理。
      注: 另外, 细胞也可以由 trypsinization, 收获在生长培养基, 转移到15毫升管和洗涤三时间与 PBS 在结冰之前。
4. 细胞裂解物的制备
   1. 并用重悬1毫升的裂解缓冲液中的细胞颗粒 (50 毫米三 pH 7.4, 500 毫米氯化钠, 0.4% SDS, 5 毫米 EDTA, 1 毫米, 1x 完全蛋白酶抑制剂) RT. 通过五克针将细胞10–20乘以十到25笔画。
   2. 用发音设备油脂实验样品。
      注: 在材料表中指示的发音设备中, 可以使用以下程序: 四周期在高强度, 三十年代每周期在冷 (4 °c) 水浴。任何其他发音设备都是合适的, 但参数可能需要相应调整。
   3. 添加海卫 X-100 到回收的微气泡裂解液达到最终浓度的 2% (通常, 添加 100 ul 20% 海卫 X-100 到 900 ul 微气泡细胞裂解), 然后2.3 毫升50毫米三, pH = 7.4 每1毫升的裂解液, 以调整氯化钠浓度到150毫米之前 binding 链亲和素耦合珠。
      关键注意事项:盐浓度越高, 对珠子的粘结效果就越低。
   4. 将调整后的裂解物分布在1.5 毫升管 (ca 1.1 毫升三管) 中, 并将其离心在 1.6万 x g, 10 分钟, 4°c.
   5. 将上清液(ca 3.2 毫升) 传输到15毫升管, 并保持 50–100 ul 作为输入材料。
   6. 测量每个样品的浓度与布拉德福德化验, 并使用相当于3到3.5 毫克蛋白质含量的链亲和素下拉。
5. 链亲和素下拉
   注意: 下拉过程的概述显示在图 4上。它几乎完全相同的原始协议, 由和同事发布的²。第一次执行下拉时, 可以将流通过和清洗第1-4 的样本放在一旁进行西方污点分析, 以确保程序正常工作 (图 5)。
   1. 对于每个条件, 转移 200 ul 的链亲和素耦合磁珠悬浮到1.5 毫升管。把管子放在磁力架上, 等到珠子粘到管子的侧面 (ca. 1 分钟) 并卸下存储缓冲区。
   2. 用1毫升平衡缓冲器 (50 毫米三 pH 7–4、150毫米氯化钠、0.05% 海卫 X-100 和1毫米) 轻轻地混合来洗涤珠子。
   3. 派遣平衡珠在必要数量的管子 (通常当开始与3–3.5 镁蛋白质含量, 裂解物从每个情况可以被派遣在二到四1.5 毫升管子) 并且安置回到磁性架子。
   4. 移除平衡缓冲器, 并并用重悬从步骤4.4.7 中的相应单元格裂解物相等数量的每组珠子。在4摄氏度的旋转车轮上孵化过夜。
   5. 在第二天, 把1.5 毫升管放在一个磁性架子上, 等到珠子粘在管子的侧面, 然后把上清液转移到一个15毫升的管子上, 把它标记为流过。
      注: 从现在起, 所有步骤都是在室温下执行的, 除非另有说明。
   6. 并用重悬每管中的珠子, 200 ul 的洗涤缓冲器 1 (2% SDS 在水中), 并结合每组悬浮珠对应一个条件在1.5 毫升管。
   7. 用1毫升的洗涤缓冲器 1, 在旋转轮上洗两次珠子8分钟。
   8. 用1毫升洗涤缓冲器 2 (50 毫米 HEPES pH 7.4, 1 毫米 EDTA, 500 毫米氯化钠, 1% 海卫 X-100 和0.1% 钠脱氧) 在旋转轮上洗两次珠子, 8 分钟。
   9. 用1毫升的洗涤缓冲器 3 (10 毫米三 pH 8, 250 毫米 LiCl, 1 毫米 EDTA, 0.5% NP-40 和0.5% 脱氧) 在旋转轮上洗两次珠子, 8 分钟。
   10. 用1毫升的洗涤缓冲器 4 (50 毫米三 pH 值 7.4, 50 毫米氯化钠, 0.1% NP-40), 在旋转轮上洗两次珠子8分钟。
   11. 要确保清洗缓冲液在最后一次清洗步骤后完全移除, 取出大部分上清, 然后向下旋转样品。把它们放回磁力架上, 等到珠子粘到管子的侧面, 然后取出剩余的缓冲器。
   12. 添加 30 ul 的洗脱缓冲 (10 毫米三 pH 7.4, 2% SDS, 5% β巯基乙醇, 和2毫米生物素) 的珠子。孵育在98°c 15 分钟, 然后立即删除磁性机架上的珠子。
   13. 将洗脱样品转移到一个新鲜的管, 并储存在-20 °c, 直到进一步处理。
6. SDS 页和西部印迹
   注: 在质谱分析之前, 建议用 SDS 页和 biotinylation 的方法评估其成功与否。如果没有观察到 biotinylation 模式, 你可能会认为 dox 或生物素没有添加到介质中, 或者两种股票溶液中的一个被破坏。
   1. 对于每个输入样本, 通过将等量的蛋白质样本与适当体积的 3x SDS 加载缓冲器混合在一起, 准备一个页面样本, 总共 28 ul。通过将每个洗脱样品的5µL 与2.5 µL 的 3x SDS 加载缓冲器混合, 准备页面样品。
   2. 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上加载样品 (25 µL/井输入, 7 µL/井用于洗脱样品)。按照3.4 节的说明进行电泳和西印迹。
   3. 如果第一次执行下拉, 通过将每个样品的20µL (输入、流经、洗涤第1-4) 与10µL 3x SDS 加载缓冲器或5µL (洗脱) 与2.5 µL 3x S 混合, 为下拉 (输入、流经、洗涤第1-4、洗脱) 的每一步准备页面样本。DS 加载缓冲区并继续执行步骤 4.6.4 (图 5)。
7. MS 分析页面
   注: 为了尽量减少潜在的角蛋白污染, 可以使用预制凝胶和商用样品加载缓冲器。
   1. 添加 6.25 ul 的4x 样本缓冲区到 18.75 ul 的每一个洗脱样品, 并运行样品在4–20% 预制 SDS 凝胶, 直到他们迁移到2–3厘米到凝胶。
   2. 在15厘米的培养皿中, 用胶体考马斯亮蓝色 G250 染色¹³着色凝胶。
   3. 使用干净的手术刀为每个样本扣除整个车道, 不包括链亲和素带 (运行在 ca 17 kDa ,图 6), 并将切除带转移到1.5 毫升管。
   4. 将这些样本发送到蛋白质组设备进行进一步分析。
      注意: 典型的 MS 结果可以在参考 9 (图 3和图 7和辅助表) 中看到。整个数据集可在自豪感存储库 (加入编号 PXD005005) 中获得。

Discussion

概述了如何将感兴趣的基因克隆到分裂-BioID 质粒中, 如何检测相互作用诱发的 biotinylation, 以及如何分离生物素化蛋白进行质量谱分析。这里我们描述了一个基于瞬变转染的过程。虽然融合蛋白的表达可以通过添加到培养基中的 dox 量来调节, 但当与内源性相比, 瞬变转染可能导致与某些细胞严重过度表达 tshr 融合蛋白的非同源蛋白表达。同行。这可能会导致相应的 interactomes 和 PPI 的扭曲, 不忠实地反映涉及内源性蛋白质的相互作用。因此, 在瞬态系统建立 BioID 后, 一般都应该构造稳定的细胞系。该质粒与 Flp 介导的重组系统相容, 并将两个感兴趣的基因置于同一种应答元素的调节之下。如果需要, 并且当使用与兼容哺乳动物细胞, 他们允许容易地创造稳定的诱导细胞线。例如, 我们使用 HeLa-EM2-11 线表达 rtTA 四环素激活转录激活剂和一个独特的多弹头基因组位点, 其中四环素介导的基因表达可以严格调节¹²。使用这一细胞线和 Flp 介导的重组, 仅含有一份转基因的稳定细胞系可以在2/3 周内获得。或者, 你也可以使用目前的基因组编辑技术, 在基因的原生基因座中引入比拉片段。

在任何依赖于标记蛋白质的化验中, 人们都需要考虑所产生的融合蛋白是否起作用。有兴趣的蛋白质被标记的可利用的数据 (例如与 GFP 为成像研究) 和功能上被测试是有用的决定是否应该克隆比拉的片断在上游或下游基因感兴趣。如果没有此类数据, 则应在功能检测中测试 n-末期或 c-末期标记蛋白。例如, 融合蛋白的活性可以在细胞系中进行检测, 其中内源蛋白已被淘汰, 并与野生类型的情况进行比较。如果兴趣的蛋白质容忍 N 和 C 终端标记, 两个应该被测试。事实上, 在 BioID 实验中, 融合蛋白的定位会影响标记²²的效率。此外, 我们观察到, 当对一对蛋白质应用分裂 BioID 时, 两种蛋白质中的哪一种被追加到 NBirA * 或 CBirA * 片段也会影响标记⁹的效率。在分裂-BioID 质粒, 16 氨基酸长甘氨酸/丝氨酸丰富的连接器耦合蛋白质的比拉 * 片段取自另一个 PCA 23, 并为我们的所有相互作用的蛋白质, 我们已经测试到目前为止.然而, 人们应该认为, 一些蛋白质对可能会更好地使用较短或更长的连接器。最后说明中, 博伦组²⁴描述了另一种检测方法。在这种化验中, 比拉 * 是分裂在另一个地点 (E140/Q141) 比我们 (E256/G257)。我们同时测试了两种分离 BioID 的风味, 发现在本协议中描述的 E256/G257 在耦合到两个相互作用的蛋白质⁹时会导致更强的重新激活。

这种方法的一个一般缺点是标签速度慢。通常, 6 到24小时的孵化时间与生物素是必要的, 以获得可观的 biotinylation⁶, 排除使用此技术研究动态重塑的蛋白质复合物。虽然这一分析部分解决了这一告诫, 因为它只在两种蛋白质相互作用的情况下激活, 标签的缓慢速度排除了它用于研究对非常动态过程的反应或分析短寿命蛋白质。工程过氧化物酶 APEX2 是已知的促进有效标记近端蛋白在1分钟³。因此, 基于 APEX2 的 PCA 可以解决 BioID 的检测速度慢的局限性。一项原则证明研究描述了这种 split-APEX2 化验²⁵。然而, 虽然 homodimerizing 蛋白是成功地生物素化, 是否也可以用于标签和识别蛋白质组装周围的一对相互作用的蛋白质仍有待证明。最近, 定向进化被用来创建 TurboID 和 miniTurbo, 两个变体的比拉 * 与增强的活动, 允许更短的标签时间窗口, 降低到10分钟²⁶。将 BioID 与这些新变体相适应将进一步将此技术应用于更广泛的应用领域。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid (glacial)	VWR	20104.298	To make TAE buffer
Agarose	Sigma	A9539	Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction
Ammonia solution 25% NH3	Bernd Kraft	6012	To dissolve biotin
Ampicillin	Sigma	A9518	To select transformed bacteria
Bioruptor plus sonification device	Diagenode	B01020001	Other sonification devices are also ok
Biotin	Sigma	B4639	To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation
Bovine serum albumin fraction V	Carl Roth	8076	Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays
Bradford Ultra reagent	Expedeon	BFU05L	Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents
Cell scrappers	TPP	99002	Any other model is also fine
ClaI	New England Biolabs	R0197	Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
DMEM medium	Sigma	D6046	If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium
DNA miniprep kit	Sigma	PLN350	Any other kit is also fine
Doxycycline	Applichem	A2951	Dox is light sensitive
DTT	Applichem	A2948	Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh
DyLight 680-conjugated streptavidin	Thermo scientific	21848	to use with a LiCor Western blot scanning device
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65002	The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)
EDTA	Applichem	A5097	Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder
Ethanol	Sigma	32205	Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit	Nippon Genetics	FG-91302	Any other kit is also fine
HCl 37%	Merck	1.00317.1000	To adjust pH of biotin stock solution
HEPES	Carl Roth	6763	Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm	Millipore	IPFL00010	This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device
LiCl	Grüssing GmbH	12083	Make a 5M stock solution
Odyssey CLx imaging system	LI-COR	N/A	To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody
Linear polyethylenimine (PEI)	Polysciences	23966-2	Any other transfection reagent is also fine
Milk powder	Carl Roth	T145	To block Western blot membranes
MluI-HF	New England Biolabs	R3198	Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
Na-deoxycholate	Sigma	30970	Make a 10% (w/v) stock solution
NaCl	Sigma	31434	Make a 5M stock solution
NP-40 (Nonidet P40 substitute)	Sigma	74385	Make a 20% (v/v) stock solution
PacI	New England Biolabs	R0547	Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Phosphate buffer saline (PBS)	Sigma	806552	To wash cells before scrapping
PmeI	New England Biolabs	R0560	Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Protease inhibitor cocktail	Roche	4693132001	Added to the lysis buffer to prevent protein degradation
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP	Addgene	90003	Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir	Addgene	90004	Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP	Addgene	90008	Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir	Addgene	90009	Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
Q5 High-Fidelity PCR kit	New England Biolabs	E0555S	To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.
Quick ligation kit	New England Biolabs	M2200S	To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.
RunBlue 4-20% SDS precast gels	Expedeon	BCG42012	To use when running samples for MS analysis
RunBlue LDS Sample Buffer	Expedeon	NXB31010	Running buffer for the RunBlue precast gels
SDS	Sigma	5030	Comes as a 20% stock solution
tet-free serum	Biowest	S181T	we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins
Trans-Blot Turbo Transfer system	Bio-Rad	1704150	High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine
Tris	Carl Roth	4855	Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)
Triton X-100	Applichem	A4975	Make a 20% (v/v) stock solution
Tween-20	Carl Roth	9127	Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step