Kvantifiera mikroglia morfologi från mikrofotografier av immunhistokemi beredd vävnad med hjälp av ImageJ

Summary

Mikroglia är hjärnan immunceller som undersökning och reagera på förändrad hjärnans fysiologi genom morfologiska förändringar som kan utvärderas kvantitativt. Denna protokollet beskrivs en ImageJ baserat analys protokoll att representera mikroglia morfologi som kontinuerlig data enligt statistikföretaget såsom cell förgrening, komplexitet och form.

Abstract

Mikroglia är hjärnan fagocyter som deltar i hjärnan homeostas och kontinuerligt kartlägga deras miljö för dysfunktion, skada och sjukdom. Som de första responders, mikroglia har viktiga funktioner att mildra neuron och glia dysfunktion och i denna process, de genomgår en rad morfologiska förändringar. Mikroglia morfologier kan kategoriseras beskrivande eller, alternativt, kan kvantifieras som en kontinuerlig variabel för parametrar såsom cell förgrening, komplexitet och form. Samtidigt metoder för kvantifiering av mikroglia tillämpas på enstaka celler, tillämpas några tekniker på flera mikroglia i en hela photomicrograph. Syftet med denna metod är att kvantifiera multipel och enstaka celler med hjälp av lättillgängliga ImageJ protokoll. Detta protokoll är en sammanfattning av stegen och ImageJ plugins rekommenderas att konvertera fluorescens och ljusa fält mikrofotografier till representativa binära och skeletterad bilder och analysera dem med hjälp av programvara plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) och FracLac för morfologi datainsamling. Resultaten av dessa plugins sammanfatta cellmorfologi när det gäller processen slutpunkter, korsningar, och längd samt komplexitet, cell form och storlek deskriptorer. Protokollet skelett analys beskrivs häri är väl lämpad för en regional analys av flera mikroglia i en hela photomicrograph eller område av intresse (ROI) medan FracLac ger en kompletterande enskild cell analys. Protokollet i kombination, och ger en objektiv, känslig och omfattande bedömningsverktyg som kan användas för att stratifiera mellan olika mikroglia morfologier finns i friska och skadade hjärnan.

Introduction

Mikroglia har ett omedelbart och olika morphologic svar till förändringar i hjärnans fysiologi¹ längs ett kontinuum av möjligheter som spänner från hyper-förgrening och mycket komplex morfologier till de förgrenat och amoeboid morfologier² . Mikroglia kan också bli polariserade och stavformade³. Mikroglia cell förgrening definieras brukar som en komplex form med flera processer och rapporteras ofta som antalet slutpunkter per cell och längden på cellprocesser. Eftersom mikroglia är fint stämda till neuronala och gliaceller funktion genom kontinuerlig cell-cell överhörning och i vivo motilitet^4,5, kan mikroglia morfologier fungera som indikatorer på olika cellfunktioner och dysfunktioner i hjärnan. En kvantitativ metod är nödvändigt att beskriva mångfalden av dessa morphologic ändringar och att urskilja skillnader bland förgrenat celler som uppstår med subtila fysiologiska störningar (t.ex. epilepsi^5,6 och hjärnskakning⁷) förutom grov skada (t.ex. stroke⁸). En ökad användning av morfologi kvantifiering^{7,8,9,10,11,12,13,14} kommer att avslöja hela mångfalden av mikroglia morfologier under hälsa och sjukdom. Nuvarande studera Detaljer stegvis användning av ImageJ plugins nödvändigt att sammanfatta mikroglia morfologi från fluorescerande eller icke-fluorescerande mikrofotografier av mikroglia förvärvat i fasta gnagare vävnad efter immunhistokemi (IHC).

Centralt att de analysmetoder som beskrivs här är ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)¹⁵, utvecklat i 2010 att kvantifiera stora bröst strukturer, och FracLac¹⁶, utvecklat under 2014 att integrera ImageJ och fractal analys till kvantifiera enskilda mikroglia former. Dessa plugins ger en snabb analys av mikroglia förgrening inom hela mikrofotografier eller flera mikroglia av en definierad ROI inom en photomicrograph. Denna analys kan användas ensamt eller i komplement med fractal analys. Den encelliga fractal analysen (FracLac) kräver en investering av tid men ger flera morfologi utgångar angående mikroglia komplexitet, form och storlek. Användning av båda verktygen är inte överflödig, som cell förgrening är komplement till cell komplexitet och en kombination av flera parametrar kan användas för att skilja mellan olika mikroglia morfologier inom datamängder^12,17.

Protocol

Alla experiment godkändes av och utförs i enlighet med de riktlinjer som fastställts av den institutionella djurvård University of Arizona och använda kommitté och NIH riktlinjerna för skötsel och användning av försöksdjur. Var försiktig att minimera djurens smärta och obehag. Dödshjälp metoder är enligt ett godkänt protokoll och bestå av livmoderhalscancer Dekapitering under isofluran anestesi.

1. vävnad förberedelse

Obs: Utföra mikroglia morfologi analys på fasta, cryoprotected vävnadsprover att bevara cellmorfologi. Följande är ett standardprotokoll för att förbereda och direkt skiva fast vävnad för fluorescens IHC.

1. Ta bort mus eller råtta hjärnor från ett euthanized djur efter önskad experimentet och enligt en standard laboratorium protokoll. Placera hjärnan i en 10 mL injektionsflaska innehåller 5 mL av en 4% PARAFORMALDEHYD lösning för 24 h vid 4 ° C. Skölj sedan och plats i 5-10 mL av en 30% sackaros fosfat buffrad lösning (PBS, 0,01 M) för 72 h vid 4 ° C. Lagra hela hjärnor vid-80 ° C tills vävnaden snittas med en kryostaten, eller vid 4 ° C om snittning med en mikrotom.
   Obs: Detta protokoll har ännu inte testats med hjälp av vävnad skivad från paraffin-inbäddat vävnad.
2. Avsnitt hjärnvävnaden till önskad snittjocklek och orientering med hjälp av antingen en kryostaten eller mikrotomen och lagra friflytande sektioner i en cryoprotection lösning (50 mM PBS, etylenglykol, glycerol) vid-20 ° C.
   Obs: Detta protokoll har framgångsrikt utförts på koronalt vävnadssnitt alltifrån 50 µm till 200 µm i tjocklek. Vävnaden avsnitt mindre än 50 µm inte kan fånga hela spannet av mikroglia processer, medan i tjock vävnadssnitt, IHC färgning kan vara ofullständig på grund av antikropp penetration in i vävnaden. Vävnaden kan vara sektionerad antingen i en koronala eller sagittal riktning och detta val kommer att bero på den experimentella mål och hjärnan region(er) studeras.

2. immunohistokemi

Obs: Skelett och fractal analysmetoder kan tillämpas på antingen fluorescens eller 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) IHC. Följande är ett standard fluorescens IHC protokoll och kan ersättas vid behov. Fluorescens IHC ger överlägsen visualisering av cell jämfört med DAB IHC.

1. Placera vävnadssnitt i en 4 mL injektionsflaska av glas (upp till 15 mus hjärnan sektioner/injektionsflaska) och inkubera i 1 mL av lösningen innehåller upp till 10% häst serum, PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN₃ vid rumstemperatur (23 ° C) för 1 h.
2. Tvätta för 5 min med PBS (0,01 M) tre gånger vid rumstemperatur.
3. Inkubera med den primär antikroppen (Iba1, 1:1, 000) vid rumstemperatur för 72 h i 1 mL lösning innehåller PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN₃och omfattas (för att bevara NaN₃ effektivitet).
4. Tvätta för 5 min med PBS (0,01 M) tre gånger vid rumstemperatur.
5. Inkubera med den sekundära antikroppar (anti-kanin 488, 1: 250) omfattas vid rumstemperatur i 4 h i 1 mL lösning innehåller PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN₃
6. Tvätta för 5 min med PBS (0,01 M) tre gånger vid rumstemperatur.
7. Montera avsnitten hjärnans vävnad (antal och orientering utifrån önskemål) subbed bilder, tillämpa en mjuk-set monteringsmedium till bild och placera täckglaset över vävnaden. Lagra bilder vid 4 ° C.
   Obs: En 1,5 glas täckglas tjocklek krävs för confocal imaging. Soft-set är en rekommenderad monteringsmedium eftersom höga viskositet inte komprimeras vävnaden och bästa behåller morfologi jämfört med hard-set montering media.

3. imaging

1. Bild Iba1 positiva celler i hjärnans vävnad avsnitt med ljusa fält eller confocal Mikroskop som har z-stack förvärv kapacitet med en 20 X objektiv eller större.
   Obs: Imaging parametrar och programvara set-up bör vara konstant för alla photomicrograph förvärv i ett experiment. Utmärkta processen detalj erhålls med hjälp av en 40 X eller 63 X-objektiv. Det är möjligt att tillämpa protokollet skelett analys beskrivs häri en hela photomicrograph eller en mång--cell ROI inom en större photomicrograph.
   1. Förvärva 8-bitars bilder med hjälp av lämplig Programvaruinställningar specifika för Mikroskop mjukvaran.
      Obs: Konvertering av filer till 8-bitars efter förvärvet kan snedvrida datainsamlingen.
   2. Skaffa minst en 30 µm z stack med högst en 2 µm intervallet mellan bilder med hjälp av lämplig programvara-inställningar som är specifika till Mikroskop mjukvaran.
      Obs: Den Mikroskop och programvara bör möjliggöra bild förvärv i en X, Y och Z-axeln. En z-stacken kan ökas, och intervallet kan minskas för att ge ytterligare mikroglia detalj. I utbyte, kommer att imaging tid öka. Använda Nyquist provtagning om möjligt för fluorescensmikroskopi.
2. Spara alla filer som Tif-filer eller som krävs enligt Mikroskop mjukvaran.
3. Öppna Tif-filer i ImageJ och använda verktygsfältet för att dela kanaler genom att klicka på bild | Färg | Split-kanaler, och stapla bilder genom att klicka på bild | Stackar | X projektet | Maximal intensitet projektion vid behov. Spara som TIF-filer.

4. skelett analys

1. Ladda ner FIJI eller ImageJ från < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. För enskilda plugins, Ladda ner AnalyzeSkeleton(2D/3D) från < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>¹⁵ och hämta FracLac från < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>¹⁶.
   Obs: Hela processen av att konvertera en photomicrograph till en binär skeletterad bild tar mindre än 1 min.
2. Om du använder en fluorescens photomicrograph, se till att bilden är 8-bitars och konvertera till gråskala till bästa visualisera alla positiva färgning. Använda verktygsfältet och klicka på bild | Uppslagstabeller | Greys. Om du använder en DAB ljusa fält fotografi, första användningen av FFT bandpass filtrera plugin (med hjälp av verktygsfältet genom att klicka Process | FFT | bandpassfilter) och sedan konvertera till gråskala.
   Anmärkning: För tillämpningen av detta protokoll skall ImageJ standardinställningarna för en FFT bandpassfilter är tillräcklig (filter upp till 3 pixlar, ner till 40, ingen stripe dämpning). Tillämpa en FFT Bandpass filter tar bort brus (små funktioner) samtidigt som de övergripande större aspekterna av bilden. Detta är särskilt användbart i ljusa fält bilder, där splittringar och sprickor i vävnaden kan visas som bakgrund och därmed komplicera skelett analys¹⁸.
3. Justera ljusstyrka och kontrast om bilden är för mörk och mikroglia processen inte kan visualiseras. Använda verktygsfältet och klicka på bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast. Justera skjutreglagen lägsta eller högsta behövs, upp till kanterna på histogrammet men ingen ytterligare.
   Obs: I ImageJ, ljusstyrka och kontrast ändras genom att uppdatera bildens uppslagstabell (LUT), så pixelvärden är oförändrade. Max och min reglagen styr nedre och övre gränserna för intervallet display, med pixelvärden över 255 visas vitt och pixelvärden under 0 visas svart¹⁸. Vid fluorescens mikrofotografier användas skjutreglaget maximal, medan skjutreglaget minsta kommer att användas för mikrofotografier av DAB målat mikroglia.
4. Kör en Oskarp Mask, filter för att ytterligare öka kontrast med hjälp av verktygsfältet genom att klicka Process | Filter | Oskarp Mask. Vid tillämpningen av detta protokoll, Imagejs standardinställningarna (en Pixelradie 3 och mask vikt 0,6) används.
   Obs: Oskarp Mask skärper och förbättrar funktionerna i kanten av en bild genom att subtrahera en suddig version av bilden (Oskarp Mask) från originalet och sedan sammanfoga den resulterande bilden med en hög kontrast version av originalbilden. Därför filtret Oskarp Mask skapar inte detaljer, men snarare klargör den befintliga detaljerat i en bild. Radien ändrat inställningar hur suddiga Oskarp Mask kommer att bli (och därmed hur mycket oskärpa kommer att tas bort), och mask vikt ändrat inställningar graden av kontrast som Oskarp Mask kommer att kopplas med (och således justerar kontrasten i den slutliga bilden).
5. Utföra ett ytutjämning steg för att ta bort melerad buller som alstras av Oskarp Mask. Använd verktygsfältet och klicka Process | Buller | Ta bort fläckar.
   Obs: Ta bort fläckar tar bort melerad brus genom att ersätta varje pixel med medianvärdet i dess 3 × 3 kvarter. Effekten är att extremvärden i intensitet ersätts av median pixeln utan att det påverkar skärpan i kanterna¹⁸.
6. Konvertera bilden till ett binärt med hjälp av verktygsfältet genom att klicka på bild | Justera | Tröskelvärde för.
   Obs: Tröskelvärde skiktas i gråskalebilder till funktioner av intresse jämfört med bakgrunden och omvandlar bilden till binärt¹⁸.
7. Tillämpa ytutjämning, nära-, och ta bort outliers funktioner: I den resulterande binära bilden, kan det finnas en bildpunkt bakgrundsljud och luckor mellan processer.
   1. Tillämpa funktionen ytutjämning med hjälp av verktygsfältet genom att klicka Process | Buller | Ta bort fläckar.
      Obs: Tillämpa avlägsna fläckar till binär bild tar bort eventuella återstående single-pixel brus.
   2. Tillämpa den close-funktionen med hjälp av verktygsfältet genom att klicka Process | Binärt | Nära.
      Obs: Denna plugin ansluter två mörka pixlar om de är avgränsade med upp till 2 pixlar.
   3. Använda funktionen Ta bort outliers med hjälp av verktygsfältet genom att klicka Process | Buller | Ta bort avskilda.
      Obs: För tillämpningen av detta protokoll skall riktas ljusa avvikare med en Pixelradie 2 och en tröskel på 50. Denna plugin ersätter en ljusa eller mörka avvikare pixel av median pixlar i området kring om den avviker med mer än ett visst värde (tröskelvärde)¹⁸.
8. Spara bilden som en separat fil för framtida användning eller fractal analys och skeletonize bilden med hjälp av verktygsfältet genom att klicka Process | Binärt | Skeletonize.
9. Välj den skeletonized bilden och kör plugin AnalyzeSkeleton(2D/3D) med hjälp av verktygsfältet genom att klicka Plugins | Skelett | Analysera skelett, och markera rutan gren Information.
   Obs: Det är troligt att bildbehandlingen kräver optimering med addition eller deletion av stegen ovan föreslagna. I den här processen bedöms skeletterad bilder för noggrannhet genom att skapa en överlagring av skelettet och den ursprungliga bilden. Somas bör vara enda ursprung punkter med processer som härrör från centrum; cirkulär somas förbrylla data och bör undvikas genom protokollet justering. Ett exempel på en enda ursprung punkt kontra cirkulär somas illustreras i figur 1.

Vanliga problem som resulterar i icke-representativa skelett och lösningsförslag:

• Bilden för mörk: konvertera till gråskala, justera reglagen för ljusstyrka/kontrast eller tillämpa Oskarp Mask
• För mycket bakgrund: Justera reglagen för ljusstyrka/kontrast, tillämpa Despeckle eller ta bort avskilda
• Cirkulär somas i skeletonized bild (särskilt för fluorescens bilder): Applicera FFT bandpassfilter, och/eller Oskarp Mask
• Sprickor i vävnad (särskilt för ljusa fält bilder): använda FFT Bandpass filter och/eller ta bort fläckar

10. Kopiera alla data från resultaten och gren information utgångar och klistra in data i ett Excel-kalkylblad.
11. I Excel, trimma data för att ta bort skelett fragment som resulterar från IHC och bild förvärv.
    1. Duplicera experiment arbetsboken med rådata utdata från skelett analys och lägga till TRIM till filnamnet. Alla efterföljande data trimning skulle inträffa i duplicerade arbetsboken att bevara rådata för framtida bruk och referens.
    2. Bestämma vilken längd av fragment ska beskäras från datamängden genom öppna skeletterad bilden i ImageJ och välja verktyget linje. Mäta flera fragment, med beaktande av den genomsnittliga längden, och besluta om ett cutoff värde.
       Obs: För att de uppgifter som presenteras här, cutoff längden för oönskad fragment är 0,5. Detta värde bör vara konsekvent i en datamängd.
    3. Anpassad sortera i Excel-kalkylbladet genom att klicka på Sortera & Filter | Anpassad sortering. Sortera efter ”endpoint voxlar” från största till minsta och i en ny nivå, genom ”Mx gren pt” från största till minsta.
    4. Ta bort alla rader som innehåller 2 slutpunkter med en högsta grenlängd av mindre än cutoff värdet (i.e., 0.5). Summera data i kolumnen slutpunkter för att beräkna det totala antalet ändpunkter insamlade från bilden.
    5. Upprepa för gren information data: sortera efter 'grenlängd' från största till minsta. Bläddra mellan data och ta bort alla rader som har en filial längd av mindre än cutoff värdet(i.e., 0.5). Summera värdena i kolumnen gren längd beräkna summerade längden på alla grenar som samlats in från bilden.
    6. Upprepa steg 4.11.3-4.11.5 för varje bild/ark tills alla data har varit trimmade och summeras.
    7. Dela data från varje bild (summeras antal slutpunkter och sammanfattade grenlängd) av antalet mikroglia somas i motsvarande bild. Ange de slutliga uppgifterna (slutpunkter deponicell & gren längd/cell) i statistisk programvara.
       Anmärkning: Summerade gren längd/celldata kan kräva konvertering från längd i pixlar till mikrometer.

5. fractal analys

Obs: FracLac är kunna köra ett antal olika form analyser som inte omfattas i detta protokoll. För en mer detaljerad förklaring av FracLac olika funktioner, se FracLac manualen på < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> och associerade referenser ^2,16,19. Fraktal analys använder tredjeparts protokollstegen 4.1-4,7 beskrivs ovan.

1. Bestämma storleken av ROI som ska användas för alla fractal analys. Använd rektangelverktyget Rita ROI. Se till att rutan är tillräckligt stor för att fånga hela cellen och kan förblir konsekvent i hela datamängden.
   Obs: Använd rektangeln valet snarare än frihand val att se till att alla ROIs samma storlek rektangeln, och cellerna har därför samma skala. Detta skulle inte vara fallet om freehand urvalet användes eftersom ImageJ kommer automatisk skalning en fyrkantig ROI att passa olika stora rektangulära fönster som resulterar i celler med olika skalor. Medan fractal former är oberoende av skalan, är fraktal analysprocessen med FracLac för ImageJ beroende av skala¹⁶. Således finns det behov av en konsekvent storlek ROI i hela datainsamling.
2. Välj slumpmässigt mikroglia för fractal analys i varje photomicrograph och motsvarande binär bild. I fönstret ROI manager, väljer du uppdatering att låsa ROI på cellens position. Använd Ctrl + Skift + D för att duplicera området inom ROI som ett nytt fönster, och sedan spara den beskurna cellen. På motsvarande binära bilden (från skelett analysen), duplicera området med samma cell med hjälp av ROI manager. Upprepa tills ett tillräckligt antal celler har valts ut slumpmässigt för fractal analys och spara alla filer.
   Obs: En slumpgenerator och en numrerade rutnätet kan användas att slumpmässigt välja celler.
3. Öppna den binära bilden med den enskilda cellen. Dubbelklicka på penselverktyget, ange färg till svart och justera borste bredd som behövs. Med den matchande photomicrograph som referens, Använd pensel att ta bort intilliggande cellprocesser, ansluta fragmenterade processer och isolera cellen av intresse. När cellen binära har isolerats, spara den binära filen.
   Obs: Holding 'alt' växlar pensel från förgrundsfärgen (svart) för bakgrundsfärgen (vit).
4. Konvertera binära cellen till en disposition som med hjälp av verktygsfältet via Process | Binärt | Disposition.
   Obs: FracLac för bild J kan användas på antingen fasta former eller formen beskriver, gällande konventionen är dock att använda formen beskriver¹⁶.
5. I verktygsfältet, öppna FracLac med hjälp av verktygsfältet genom att klicka Plugins | Fraktal analys | FracLac och välj BC (rutan räkna). I Rutnätet Design inställningar, ange Num G 4. Under grafik alternativ, markera rutan mätvärden för att analysera konvex skrov och markeringsramen cirkel av cellen. När du är klar väljer du OK.
   Obs: Num G är rutan räkna rutnät riktlinjer används under genomsökningen antal och rekommenderat intervall för Num G är 4-12. Inställningen Num G och föreslagna spänna granskas grundligt i FracLac manuell¹⁶. Ökande Num G kan betydligt långsam beräkning gånger. FracLac inställningar behöver bara ställas in en gång per session. När inställningarna har tagits upp, blir knappen Skanna tillgängliga.
6. Välj knappen Skanna till genomsöker box-räkna på den valda bilden.
   Obs: Skanningen kommer att generera tre fönster med data utgångar: skrov och cirkel resultat, Box Count Sammanfattning fil och skanna typer. Fönstret Skanna typer innehåller en logg med de inställningar som används, samt som standard avvikelser för vissa åtgärder. För tillämpningen av detta protokoll skall kan fönstret Skanna typer används inte och vara stängd eller sparas för framtida referens.
7. Kopiera alla önskade data i fönstret skrov och Cirkel resultat (dvs., densitet, baserat på span och loopkontroll) resultat. I fönstret Rutan räkna Sammanfattning kopiera önskade data (dvs., fraktala dimensionen och lacunarity) resultat. Överföra kopierade data till en Excel-fil eller statistisk programvara.
   Obs: En fullständig lista över FracLac utgång data tillhandahålls och grundligt förklaras i FracLac för ImageJ manuell¹⁶.

Discussion

Mikroglia celler är fint stämda till fysiologi och patologi inom sina mikro-domäner och visa en rad olika morfologier² i både subtila^7,14 och grov skada⁸. Användning av ImageJ protokoll gör mikroglia morfologi kvantifiering tillgänglig för alla laboratorier som plattform och plugins är ett bildbehandlingsprogram för öppen källkod. Protokollet beskrivs är fokuserat på bildbehandling och analys med hjälp av denna programvara, börjar konsekvens av datainsamling, giltighet och tillförlitlighet med utmärkta IHC och mikroskopi. Detta protokoll används för att förbättra binär, skelett och disposition representationer av hela mikrofotografier och enstaka celler men inte kan ta platsen för fattiga IHC färgning och mikroskopi som resulterar i låg kontrast, suddig eller förvrängd bilder. Som en ytterligare övervägande, måste försiktighet iakttas inte att platta hjärnvävnaden under lagring, innan snittning, som oåterkalleligen ändrar mikroglia morfologi. Slutligen, inom varje experiment, mikroglia måste avbildas med samma skala samt samma mikroskopet. Instrumentering, mål och programvara varierar bland Mikroskop vilket kommer att resultera i olika storlek mikrofotografier trots liknande mål och ändra detaljerna liksom antalet celler i varje ram. Till exempel resulterar bild förvärv med ett 40 X-objektiv på en Leica SPII i två gånger antalet celler och mindre detaljer än förvärv med en Zeiss 880. Detta är särskilt viktigt för cell förgrening insamlade från hela bildrutan i stället för en enda cell, som detta blir en fråga om data provtagning.

I allmänhet föregår skelett analys som utnyttjar den hela photomicrograph enda cell fractal analysen av två skäl. Avgörande cell förgrening av alla celler i en photomicrograph är snabb när jämfört med enstaka cell fractal analysen och kan betraktas som en screeningmetod om tid är en faktor. Dessutom används de binära bilder härrör under skelett analys för fractal analys. När avbildas, finns det ett antal kritiska steg som kan påverka skelett analysresultat och införa brukarinflytande. Protokollstegen som är mest variabla mellan användare är steg 4,2 (öka bildens ljusstyrka) och steg 4,5 (fastställandet av tröskelvärdet). Om möjligt, en optimal nummer att öka ljusstyrka (max eller min skjutreglaget mellan 0-255) bestäms och hölls konstant för alla bilder och användare. Där bilden variationen är stor, kan användaren i stället välja en ljusstyrka som varierar mellan bilderna. Alternativt, om bilder är ljusa och kontrasten är hög, då ökande ljusstyrka kan utelämnas och tröskelvärde kan normaliseras med hjälp av en specialitet tröskel filter (t.ex., Huang) snarare än mer varierande standard. När optimerad, bör parametrar följas för att minimera ytterligare användare-påverkan.

Ett exempel på användaren variabilitet presenteras i figur 5. Datavärden höjdes i användare 1 kontra användare 2 och därför variabilitet skulle höjas om både användare 1 och användare 2 bidragit till datainsamling. Ett exempel på skillnader i användare 1 och användare 2 binära och skeletterad bilder är markerade med färgade cirklar (figur 5). I detta fall var båda användarna kort utbildade studenter med begränsade sakkunskapen i mikroglia. Regelbunden tillsyn och mentorskap av en mikroglia expert tillsammans med ökad protokoll utbildning² kan minska mellan användaren variabilitet. Men inte bedömas här, är fraktal analys mindre föremål mellan användaren variabilitet eftersom binära celler är manuellt och individuellt isolerade från en photomicrograph i stället för att enbart förlita sig på tröskelvärde att bestämma mikroglia former. Dock äger alla metoder vissa variationer mellan användare. Därför, en enskild användare (idealiskt, utbildad av viss expertis inom mikroglia celler) bör slutföra datainsamlingen för en hela datamängden.

Ytterligare ändringar kan göras enkelt till detta protokoll och beror på bildkvalitet och de ansträngningar som vidtagits för att minska buller och säkerställa processen anslutning. Till exempel om kontrasten är adekvat, sedan oskarp mask är inte nödvändigt och kan utelämnas. Det är klokt att optimera och slutföra protokollet för en specifik uppsättning bilder, både experimentella fall och kontroller, före datainsamling från en hel uppsättning. Slutligen, ytterligare plugins kan användas i stället för andra att förtydliga eller skärpa bilder som inte beskrivs i detta protokoll såsom vidgas eller slipa.

Fördelarna med detta protokoll är dess universella tillgänglighet och anpassningsförmåga. Bedömningen av cell förgrening med AnalyzeSkeleton är dessutom snabb och gäller för en hela photomicrograph. En fördel med mång--cell analys strategi är fokus på en hel region i stället för enstaka celler. Därför är det möjligt att snabbt bedöma den genomsnittliga förgrening (avseende endpoints och processen längd) av alla mikroglia i bilden. Skelett-analysen ger en analys av flera celler: en datasampling när det gäller cell nummer som inte kan matchas av fraktal analys på grund av tid som krävs investeringar att isolera enstaka celler från mikrofotografier. En instans där detta kan vara bäst vore screening mikroglia morfologier i anslutning till en fokal skada. En begränsning är den hela fältet bildåtergivning skapa skelett modeller av IHC mikrofotografier är ofullkomlig jämfört med metoden mer tidskrävande enda cell. Dessutom är en regionen analys inte lämpligt till omständigheter där mikroglia morfologier är drastiskt olika inom samma område. Slutligen, denna analysmetod är beroende av celltal, en parameter som kan skilja sig mellan experimentella förhållanden.

Fraktal analys utförs på en enda cell och därför kompletterar den genomsnittliga cell förgrening utdata från skelett analysen. Även om mycket mer tidsödande, denna investering ger en behaglig morfometriska data. Till exempel cell densiteten, span förhållande, och loopkontroll data beskriva storleken, töjning och formen på cell dispositionen, respektive. Fraktala dimensionen och lacunarity sammanfatta cell komplexitet och form heterogenitet, respektive. En mer djupgående Sammanfattning av hur varje parameter beräknas och hur data kan tolkas finns i interaktiva manuell¹⁶ och sådan detalj övervägas i förhållande till den specifika frågeställningen. Protokollet beskrivs resulterar i känsliga verktyg att kvantifiera små förändringar i 2D mikroglia morfologier som kan uppstå i fysiologiska och patologiska förhållanden. Ytterligare morfometriska analys som Soliditet, konvexitet och form faktorn^16,20 kan vara möjligt om genererar 3D-former.

Protokoll utveckling och anpassning är kontinuerlig och användardriven. Det har utvidgats från fluorescens⁸ till DAB/ljusa-fältet bilder⁷ men ännu inte att paraffin inbäddade vävnad. Det tillägg, det kan användas tillsammans med proprietär programvara såsom Imaris för ytterligare analys. Detta protokoll kan tillämpas på en mängd olika fysiologi och är inte begränsat till mikroglia men kan tillämpas på någon cell eller vävnad med särskilt mönster eller former som kan identifieras med IHC metoder. Slutligen, med tillräcklig urvalsstorlek, en multivariat eller kluster analys kan användas för att stratifiera mikroglia enligt morfologi^12,21. Detta är meningsfull information som mikroglia morfologi är en viktig indikator på mikroglia funktioner och Svaren till sin omgivning. Uppskattning för mikrogliala morphologic mångfald är expanderande och viktigt att fullt ut förstå neuron-glia-vaskulär interaktioner under hälsa och sjukdom. Tillväxt inom detta område förstärks av välutvecklade, lätt att använda och reproducerbara protokoll att kvantifiera och sammanfatta mikroglia morfologi med flera kontinuerliga variabler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
primary antibody anti-IBA1	Wako	019-19741	rabbit host
Vectashield soft mount	Vector Labs	H-1000
Secondary antibody	Jackson ImmunorResearch	711-545-152	donkey host
4 mL glass vial	Wheaton	UX-08923-11
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S-8032
glass coverslip	Fisher Scientific	12-544-G