تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Summary

يتم تنشيط في مرحلة دورة الخلية G2 كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) وينظم العديد من المسارات الخلوية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة كيناز في المختبر مع Cdk1، مما يتيح تحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة لتحديد الأهداف الخلوية من هذا كيناز الهامة.

Abstract

كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) هو وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية في جميع حقيقيات النوى، وفوسفوريلاتيس ما يقدر 8-13 ٪ من البروتين؛ ومع ذلك، العدد الأهداف المحددة ل Cdk1، لا سيما في الخلايا البشرية لا يزال منخفضا. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة المهم، كما أنها توفر الميكانيكية ثاقبة كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية. تنظيم دورة الخلية أمر حاسم للعزل الصبغي المؤمنين، والعيوب في هذه العملية المعقدة تؤدي إلى الكروموزومي والسرطان.

هنا، يمكننا وصف في المختبر كيناز مقايسة المستخدمة لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة. في هذا التحليل، بروتين المنقي فوسفوريلاتيد في المختبر بنجاح ب Cdk1/cyclin البشرية المتاحة تجارياً الفسفرة ما يؤكده الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، ويتم فيما بعد تحديد مواقع الفسفرة من الطيف الكتلي. ونحن أيضا وصف تنقية البروتوكولات التي تسفر عن الاستعدادات البروتين عالية نقية ومتجانسة مناسبة للمقايسة كيناز، ومقايسة ملزمة التحقق الوظيفية للمواقع المحددة الفسفرة، الذي يسبر التفاعل بين إشارة تعريب نووية كلاسيكية (أدى) وبه α كاريوفيرين مستقبلات النقل النووي. للمساعدة مع التصميم التجريبي، نقوم بمراجعة النهج للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 محددة من تسلسل البروتين. معا هذه البروتوكولات الحالية اتباع نهج قوية جداً غلة مواقع الفسفرة Cdk1 محددة وتمكن الدراسات الميكانيكية في كيفية Cdk1 يتحكم في دورة الخلية. حيث يعتمد هذا الأسلوب على البروتينات المنقاة، يمكن تطبيقها على أي نموذج الكائن الحي وغلة نتائج يمكن الاعتماد عليها، خاصة عندما تقترن بخلية الدراسات الفنية.

Introduction

مؤنزم هي الإنزيمات التي نقل مجموعات الفوسفات من ATP على ركائز وتنظيم العديد من العمليات الخلوية. هذا الفسفرة يتم عكسها وسريع، يضيف تهمتين تتعلقان بالسلبية، ويخزن الطاقة الحرة وهو واحد من التعديلات بوسترانسلاشونال الأكثر شيوعاً المستخدمة من قبل الخلايا. Cdk1، ويعرف أيضا باسم دورة انقسام الخلية البروتين 2 هومولوج (cdc2) وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية في جميع حقيقيات النوى^1،2،3،،من⁴⁵، وفوسفوريلاتيس ما يقدر 8-13 ٪ من البروتين^6،7.

Protocol

1-التنبؤ بمواقع محددة Cdk1 الفسفرة من تسلسل البروتين

1. قبل بدء الفحص كيناز، تحليل تسلسل البروتين لتوقع مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة والبحث في الأدب لمواقع الفسفرة تجريبيا المنشأة مع خصوصية كيناز غير معروف. استخدم الأدوات التالية، وقواعد البيانات والمراجع التي يرد.
   1. استخدام iGPS 3.0 البرنام?.......

Discussion

لدينا الإنزيم كيناز في المختبر هو وسيلة قوية جداً لتحديد أهداف جزيئية كيناز Cdk1، الذي هو وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية وينظم العديد من العمليات الخلوية الهامة. الأسلوب يحدد إذا كان بروتين المنقي هو ركيزة ل Cdk1، ويسمح لتحديد مواقع محددة الفسفرة. وهذا يسهل الدراسات الميكانيكية لتنظيم ال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778