用体外激酶法鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1特异磷酸化部位

Summary

细胞周期蛋白依赖性激酶 1 (Cdk1) 在 G2 阶段被激活并且调控许多细胞通路。在这里, 我们提出了一个协议的体外激酶检测与 Cdk1, 这使得识别 Cdk1-specific 磷酸化的网站, 以建立细胞目标的这个重要的激酶。

Abstract

周期蛋白依赖性激酶 1 (Cdk1) 是一个主控制器为细胞周期在所有真核生物和 phosphorylates 估计 8-13% 的蛋白质组;然而, 已确定的 Cdk1 目标的数目, 特别是在人类细胞中的数量仍然很低。Cdk1-specific 磷酸化部位的鉴定是重要的, 因为它们提供了机械的洞察力如何 Cdk1 控制细胞周期。细胞周期调节对忠实的染色体分离至关重要, 而在这个复杂过程中的缺陷导致染色体畸变和癌症。

在这里, 我们描述了一个体外激酶检测, 用于识别 Cdk1-specific 磷酸化部位。在本试验中, 纯化蛋白是通过商业上可获得的人类 Cdk1/cyclin 磷酸化而成的体外b. 成功的磷酸酶是由 SDS 页确认的, 并且随后用质谱法鉴定磷酸的部位。我们还描述了纯化的协议, 产生高纯度和均匀的蛋白质制剂, 适合于激酶的检测, 和结合试验的功能验证鉴定的磷酸化部位, 探讨之间的相互作用经典核定位信号 (cNLS) 及其核传输受体 karyopherin α。为了辅助实验设计, 我们回顾了从蛋白质序列预测 Cdk1-specific 磷酸化部位的方法。这些协议一起提供了一个非常强大的方法, 产生 Cdk1-specific 磷酸化网站, 并使机械研究如何 Cdk1 控制细胞周期。由于这种方法依赖于纯化的蛋白质, 它可以应用于任何模型有机体和产生可靠的结果, 特别是当结合细胞功能研究。

Introduction

激酶是将磷酸酯从 ATP 转移到基质并调节许多细胞过程的酶。这种磷酸化是可逆的, 快速的, 增加两个负电荷, 并储存自由的能量, 是最常见的翻译后修改之一, 细胞使用。Cdk1, 也称为细胞分裂周期蛋白2同源 (cdc2) 是所有真核生物的细胞周期的主控制器^1,2,3,4,5, 和 phosphorylates 一个估计8-13% 的蛋白质组^6,7。

虽然最近的蛋白质组研究已经确定了许多蛋白质磷酸化部位, 在大多数情况下, 负责这些修改的激酶是未知的。已知的 Cdk1 目标 (特别是在人类细胞中) 的数量低⁷。Cdk1-specific 磷酸化部位的鉴定是很重要的, 因为它能使机械学研究确定 Cdk1 如何控制细胞周期。细胞周期调节对于忠实的染色体分离和细胞分裂是很重要的, 需要大量的细胞过程来支持这个重要的生理功能。这包括在有丝分裂开始前停止转录和翻译, 以及细胞结构和组织的戏剧性重组, ....

Protocol

1. 从蛋白质序列预测 Cdk1-specific 磷酸化部位

1. 在开始激酶测定之前, 分析预测的 Cdk1-specific 磷酸化部位的蛋白质序列, 并在实验性地建立具有未知激酶特异性的磷酸化部位的文献。使用汇总的下列工具、数据库和引用。
   1. 使用 iGPS 3.0 软件^36、37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) 预测目标蛋白质序列中的 Cdk1-specific 磷酸化站点。使用此处的链接进?.......

Discussion

我们的体外激酶检测是一种非常有效的方法来识别激酶 Cdk1 的分子靶点, 它是细胞周期的主控制器, 调节许多重要的细胞过程。该方法确定纯化蛋白是否为 Cdk1 的基质, 并允许识别特定的磷酸化部位。这促进机械研究通过磷酸化通过 Cdk1 调控细胞过程。

质谱法成功识别磷酸化部位的最关键因素是激酶测定的磷酸化效率。个别场址的磷酸化效率应尽可能高, 最好是100%。这?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778