Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Summary

Cyclin-afhængig kinase 1 (Cdk1) er aktiveret i G2 fase af cellecyklus og regulerer mange cellulære veje. Her præsenterer vi en protokol for en in vitro- kinase assay med Cdk1, som giver mulighed for identifikation af Cdk1-specifikke fosforylering websteder til oprettelse af cellulære mål for denne vigtige kinase.

Abstract

Cyclin-afhængig kinase 1 (Cdk1) er en master controller til cellecyklus i alle eukaryoter og phosphorylates anslås 8-13% af proteomet; men antallet af identificerede mål for Cdk1, især i humane celler er stadig lav. Identifikation af Cdk1-specifikke fosforylering websteder er vigtigt, da de giver mekanistiske indblik i hvordan Cdk1 kontrol af cellecyklus. Celle cyklus regulering er kritisk for trofaste kromosom opdeling, og mangler i denne komplicerede proces føre til kromosomforandringer og kræft.

Her, beskriver vi en in vitro- kinase assay, der bruges til at identificere Cdk1-specifikke fosforylering websteder. I denne analyse, et oprenset protein er fosforyleres i vitro af kommercielt tilgængelige menneskelige Cdk1/cyclin B. vellykket fosforylering er bekræftet af SDS-PAGE og fosforylering websteder er efterfølgende identificeret ved massespektrometri. Vi beskriver også rensning protokoller, der giver meget rene og homogen protein præparater egnet til kinase assay, og et bindende assay funktionelle verifikation af de identificerede fosforylering websteder, som sonder samspillet mellem en klassisk nukleare lokalisering signal (cNLS) og dens nukleare transport receptor karyopherin α. Hjælp med eksperimentelle design, gennemgår vi metoder til forudsigelse af Cdk1-specifikke fosforylering websteder fra protein-sekvenser. Sammen præsentere disse protokoller en meget kraftfuld tilgang, der giver Cdk1-specifikke fosforylering websteder og muliggør Mekanistiske undersøgelser i hvordan Cdk1 kontrol af cellecyklus. Da denne metode er baseret på rensede proteiner, kan det anvendes på enhver model organisme og udbytter pålidelige resultater, især når den kombineres med celle funktionelle studier.

Introduction

Kinaser er enzymer, overføre fosfat grupper fra ATP på substrater og regulere mange cellulære processer. Denne fosforylering er reversibel, hurtigt, tilføjer to negative afgifter, og gemmer fri energi og er en af de mest almindelige posttranslationelle modifikationer bruges af celler. Cdk1, som er også kendt som celledeling cyklus protein 2 homolog (cdc2) er en master controller til cellecyklus i alle eukaryoter^1,2,3,4,5, og phosphorylates en anslåede 8-13% af proteomet^6,<....

Protocol

1. forudsigelse af Cdk1-specifikke fosforylering websteder fra Protein sekvens

1. Før du begynder kinase assay, analysere protein sekvensen for forventede Cdk1-specifikke fosforylering websteder og Søg litteratur for eksperimentelt etablerede fosforylering websteder med ukendt kinase specificitet. Brug følgende værktøjer, databaser og referencer, der opsummeres.
   1. Bruge BGB 3.0 software^36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) til at foru.......

Discussion

Vores in vitro- kinase assay er en meget kraftfuld metode til at identificere molekylære mål for kinase Cdk1, som er en master controller af cellecyklus og regulerer mange vigtige cellulære processer. Metoden bestemmer, om et oprenset protein er et substrat for Cdk1 og giver mulighed for identificering af specifikke fosforylering websteder. Dette letter Mekanistiske undersøgelser for regulering af cellulære processer ved fosforylering gennem Cdk1.

Den mest kritiske faktor for suc.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778