Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse

Summary

Kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) intervient dans la phase G2 du cycle cellulaire et régule les nombreuses voies cellulaires. Ici, nous présentons un protocole de test in vitro kinase Cdk1, qui permet l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques pour l’établissement de cibles cellulaires de cette kinase importante.

Abstract

Kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) est un contrôleur maître du cycle cellulaire chez tous les eucaryotes et phosphoryle environ 8 à 13 % du protéome ; Toutefois, le nombre de cibles identifiées pour Cdk1, particulièrement dans les cellules humaines est encore faible. L’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique est importante, car elles donnent des indications mécanistes sur comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire. Régulation du cycle cellulaire est cruciale pour la ségrégation des chromosomes fidèle, et défauts dans ce complexe processus conduisent à des aberrations chromosomiques et le cancer.

Nous décrivons ici une analyse de kinase in vitro qui est utilisée pour identifier les sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques. Dans ce test, une protéine purifiée est phosphorylée in vitro par disponibles dans le commerce humain Successful Cdk1/cycline B. phosphorylation est confirmée par SDS-PAGE et sites de phosphorylation sont par la suite identifiés par spectrométrie de masse. Nous décrivons également les protocoles de purification qui donnent des préparations de protéines très pure et homogène qui conviennent à l’analyse de la kinase et un essai de liaison pour la vérification fonctionnelle des sites de phosphorylation identifiés, qui sonde l’interaction entre un signal de localisation nucléaire classique (cNLS) et son récepteur de transport nucléaire IMPORTINE α. Pour vous aider avec le plan expérimental, nous passons en revue les approches pour la prédiction des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique de séquences protéiques. Ces protocoles présentent ensemble une approche très puissante qui donne des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques et permet des études mécanistes dans Comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire. Étant donné que cette méthode s’appuie sur les protéines purifiées, il peut être appliqué à n’importe quel modèle organisme et rendements des résultats fiables, surtout lorsqu’il est combiné avec des études fonctionnelles cellulaire.

Introduction

Kinases sont des enzymes transfer groupements phosphate de l’ATP sur des substrats et de réguler les nombreux processus cellulaires. Cette phosphorylation est réversible, rapide, ajoute deux charges négatives et emmagasine l’énergie libre et est l’une des modifications post-traductionnelles couramment utilisées par les cellules. CDK1, qui est également connu sous le nom homologue de protéine 2 cycle de division cellulaire (cdc2) est un contrôleur maître du cycle cellulaire dans tous les eucaryotes^1,2,3,4,5e....

Protocol

1. la prévision des Sites de Phosphorylation de Cdk1 spécifique de la séquence protéique

1. Avant de commencer l’analyse de la kinase, analyser la séquence protéique pour sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques prévus et rechercher la littérature pour les sites de phosphorylation établie expérimentalement avec une spécificité kinase inconnu. Utilisez les outils suivants, bases de données et références qui sont résumées.
   1. Les circuits graphiques intégrés 3.0 logiciel

Discussion

Notre analyse de kinase in vitro est une méthode très puissante pour identifier des cibles moléculaires pour la kinase Cdk1, qui est un contrôleur maître du cycle cellulaire et régule les nombreux processus cellulaires importants. La méthode détermine si une protéine purifiée est un substrat pour la Cdk1 et permet l’identification de sites de phosphorylation spécifiques. Ceci facilite les études mécanistiques pour régulation de processus cellulaires par phosphorylation par l’intermédiaire de C.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778