Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Summary

Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) wird in der G2-Phase des Zellzyklus aktiviert und reguliert viele zelluläre Signalwege. Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine in-vitro- Kinase Assay mit Cdk1, wodurch die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites für zellulare Ziele von diesem wichtigen Kinase.

Abstract

Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) ist ein master-Controller für den Zellzyklus in allen Eukaryoten und schätzungsweise 8-13 % des Proteoms phosphorylates; die Anzahl der identifizierten Ziele für Cdk1, besonders in den menschlichen Zellen ist jedoch nach wie vor niedrig. Die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ist wichtig, da sie mechanistische Einblicke in wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Regulierung des Zellzyklus ist entscheidend für die treuen Chromosom Abtrennung und Mängel in diesen komplizierten Prozess zu Chromosomenaberrationen und Krebs führen.

Hier beschreiben wir einen in-vitro- Kinase Assay, der verwendet wird, um Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites zu identifizieren. In diesem Test ist ein gereinigtes Protein phosphorylierten in Vitro kommerziell verfügbare menschliche Cdk1/cyclin B. erfolgreich Phosphorylierung wird bestätigt durch SDS-PAGE und Phosphorylierung Websites werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Wir beschreiben auch Reinigung-Protokolle, die Ausbeute sehr reine und homogene Protein Vorbereitungen für die Kinase Assay und eine verbindliche Assay für die funktionale Verifikation der identifizierten Phosphorylierung-Standorte, die die Interaktion zwischen den Sonden ein klassischer nuklearen Lokalisierung-Signal (cNLS) und seine Nukleartransporten Rezeptor Karyopherin α. Experimentelles Design unterstützen, überprüfen wir Ansätze für die Vorhersage von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites von Proteinsequenzen. Zusammen stellen diese Protokolle einen sehr leistungsfähigen Ansatz, der Renditen Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites und mechanistische Studien in wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Da diese Methode stützt sich auf gereinigten Proteinen, kann es zu jedem Modell Organismus und Erträge zuverlässige Ergebnisse, vor allem in Kombination mit Zelle funktionelle Studien angewendet werden.

Introduction

Kinasen sind Enzyme, die Übertragung von Phosphatgruppen von ATP auf Substraten und regulieren viele zelluläre Prozesse. Diese Phosphorylierung ist reversibel, schnell, fügt zwei negative Ladungen und freie Energie speichert und gehört zu den häufigsten posttranslationale Modifikationen von Zellen verwendet. Cdk1, die auch bekannt als Zellteilung Zyklus Protein 2 Homolog (cdc2) ist ein master-Controller für den Zellzyklus in allen Eukaryoten^1,2,3,4,5, und phosphorylates ein Geschätzte 8 bis 13 % des Proteom....

Protocol

(1) Vorhersage von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Webseiten, die auf die Proteinsequenz

1. Analysieren Sie vor Beginn der Kinase Assay die Proteinsequenz für vorhergesagten Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites und suchen Sie die Literatur für experimentell etablierten Phosphorylierung Websites mit unbekannten Kinase Spezifität zu. Verwenden Sie die folgenden Tools, Datenbanken und Referenzen, die zusammengefasst sind.
   1. Verwenden Sie die iGPS 3.0 Software^36,

Discussion

Unsere in-vitro- Kinase Assay ist eine sehr leistungsfähige Methode zur Identifizierung von molekularer Zielstrukturen für die Kinase Cdk1, die eine übergeordnete Steuerung des Zellzyklus und reguliert viele wichtige zelluläre Prozesse. Die Methode bestimmt, ob ein gereinigtes Protein ein Substrat für Cdk1 ist und ermöglicht die Identifizierung von spezifischen Phosphorylierung Websites. Dies erleichtert die mechanistische Studien zur Regulation zellulärer Prozesse durch Phosphorylierung durch Cdk1.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778