זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Summary

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

Abstract

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) הוא בקר ראשיים עבור המחזור תאים פרוקריוטים כל ו phosphorylates של % 8-13 המשוערת של פרוטאום; עם זאת, המספר של מטרות מזוהה Cdk1, במיוחד בתאי אדם הוא עדיין נמוך. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 חשוב, כפי שהם מספקים תובנות מכניסטית איך Cdk1 שולט מחזור התא. מחזור התא תקנה הוא קריטי עבור נאמן כרומוזום סגרגציה, פגמים בתהליך מורכב זה להוביל סטיות כרומוזומליות וסרטן.

כאן, אנו מתארים של במבחנה קינאז assay המשמש כדי לזהות אתרי זירחון ספציפית Cdk1. זה assay, חלבון מטוהרים שוכן phosphorylated במבחנה על ידי זמינים מסחרית מוצלחת ב' בני אדם Cdk1/cyclin זרחון אושר על ידי עמודים מרחביות, אתרי זירחון לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה. נתאר גם פרוטוקולים טיהור המניבים ההכנות חלבון מאוד טהור, הומוגני מתאים וזמינותו קינאז, ואת וזמינותו של איגוד עבור אימות פונקציונלי של האתרים זרחון מזוהה, אשר חוקרת את האינטראקציה בין אות לוקליזציה הגרעינית הקלאסית (cNLS), שלה α karyopherin קולטן של נשק גרעיני. כדי לסייע עם עיצוב ניסיוני, אנו בודקים גישות לחיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מ רצפי חלבונים. יחד פרוטוקולים אלה מציגים גישה רבת עוצמה מניב אתרי זירחון Cdk1 ספציפית ומאפשרת מחקרים מכניסטית לתוך כמה Cdk1 שולט מחזור התא. מאז בשיטה זו מסתמך על חלבונים מטוהרים, יכול להחיל אותה על כל דגם האורגניזם, התשואות תוצאות אמינות, במיוחד בשילוב עם לימודי תפקודי התא.

Introduction

Kinases הם אנזימים להעביר קבוצות פוספט מ- ATP על גבי מצעים ולווסת תהליכים תאיים רבים. זרחון זה הוא הפיך, מהר, מוסיף שני מטענים שליליים, ו מאחסן אנרגיה חופשית, לאחד השינויים posttranslational הנפוצים ביותר בשימוש על ידי התאים. Cdk1, אשר ידוע גם בשם homolog חלבון 2 מחזור חלוקת התא (cdc2) הוא בקר ראשיים עבור מחזור התא כל פרוקריוטים^1,2,3,4,5, phosphorylates משוער 8-13% פרוטאום^6,7.

בעוד מחקרים פרוטיאומיה מבנית זיהו אתרים רבים ....

Protocol

1. חיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מהרצף חלבון

1. לפני תחילת וזמינותו קינאז, לנתח את רצף החלבון עבור אתרי זירחון ספציפי Cdk1 החזוי, חיפוש הספרות עבור אתרי זירחון השפעול הוקמה עם ירידה לפרטים קינאז לא ידוע. השתמש הבאים כלים, מאגרי מידע, הפניות המסוכמים.
   1. השתמש iGPS 3.0 תוכנה^36,

Discussion

שלנו assay קינאז במבחנה היא שיטה רבת עוצמה כדי לזהות מטרות מולקולריות עבור קינאז Cdk1, אשר הוא בקר מאסטר של מחזור התא, מווסת תהליכים תאיים חשובים רבים. השיטה קובעת אם חלבון מטוהרים מצע עבור Cdk1, מאפשר זיהוי של אתרי זירחון ספציפיים. זה מקל על מכניסטית ללימודי ויסות תהליכים תאיים על ידי זרחון ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778