Cyclin के आश्रित कळेनासे 1 विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान एक इन विट्रो कळेनासे परख

Summary

Cyclin-निर्भर कळेनासे 1 (Cdk1) कोशिका चक्र के G2 चरण में सक्रिय है और कई सेलुलर रास्ते नियंत्रित करता है । यहां, हम Cdk1, जो इस महत्वपूर्ण कळेनासे के सेलुलर लक्ष्य स्थापित करने के लिए Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान की अनुमति देता है के साथ एक इन विट्रो कळेनासे परख के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।

Abstract

Cyclin-निर्भर कळेनासे 1 (Cdk1) सभी eukaryotes में सेल चक्र के लिए एक मास्टर नियंत्रक है और phosphorylates एक अनुमानित 8-13% proteome; हालांकि, विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में Cdk1 के लिए पहचान लक्ष्यों की संख्या अभी भी कम है । Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान महत्वपूर्ण है, के रूप में वे यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कैसे Cdk1 कोशिका चक्र को नियंत्रित करता है । सेल चक्र विनियमन वफादार गुणसूत्र अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है, और इस जटिल प्रक्रिया में दोष गुणसूत्र विचलन और कैंसर के लिए नेतृत्व ।

यहां, हम इन विट्रो कळेनासे परख है कि Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है का वर्णन । इस परख में, एक शुद्ध प्रोटीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव Cdk1 द्वारा इन विट्रो में phosphorylated है/cyclin बी सफल फास्फारिलीकरण एसडीएस द्वारा पुष्टि की है-पृष्ठ, और फास्फारिलीकरण साइटों को बाद में जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान कर रहे हैं । हम भी शुद्धि प्रोटोकॉल है कि उच्च शुद्ध और सजातीय प्रोटीन कळेनासे परख के लिए उपयुक्त तैयार उपज का वर्णन है, और फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान की कार्यात्मक सत्यापन के लिए एक बाध्यकारी परख है, जो के बीच बातचीत की जांच एक शास्त्रीय परमाणु स्थानीयकरण संकेत (cNLS) और उसके परमाणु परिवहन रिसेप्टर karyopherin α. प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ सहायता करने के लिए, हम प्रोटीन दृश्यों से Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की भविष्यवाणी के लिए दृष्टिकोण की समीक्षा करें । एक साथ इन प्रोटोकॉल एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि पैदावार Cdk1 विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों और यंत्रवत अध्ययन में सक्षम बनाता है कैसे Cdk1 कोशिका चक्र को नियंत्रित करता है । इस विधि के बाद से शुद्ध प्रोटीन पर निर्भर करता है, यह किसी भी मॉडल जीव और पैदावार विश्वसनीय परिणाम के लिए लागू किया जा सकता है, खासकर जब सेल कार्यात्मक अध्ययन के साथ संयुक्त ।

Introduction

Kinases कि एंजाइमों सब्सट्रेट पर एटीपी से फॉस्फेट समूहों हस्तांतरण और कई सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित कर रहे हैं. इस फास्फारिलीकरण प्रतिवर्ती है, तेजी से, दो नकारात्मक शुल्क कहते हैं, और मुक्त ऊर्जा भंडार है, और सबसे आम posttranslational कोशिकाओं द्वारा इस्तेमाल संशोधनों में से एक है । Cdk1, जो भी कोशिका विभाजन चक्र प्रोटीन 2 homolog (cdc2) के रूप में जाना जाता है सभी eukaryotes^1,2,3,4,5, और phosphorylates एक में सेल चक्र के लिए एक मास्टर नियंत्रक है proteome^6,

Protocol

1. प्रोटीन अनुक्रम से Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की भविष्यवाणी

1. कळेनासे परख शुरू करने से पहले, भविष्यवाणी Cdk1-विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों के लिए प्रोटीन अनुक्रम का विश्लेषण और अज्ञात कळेनासे ?.......

Discussion

हमारे इन विट्रो कळेनासे परख एक बहुत शक्तिशाली तरीका कळेनासे Cdk1 है, जो सेल चक्र के एक मास्टर नियंत्रक है और कई महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है के लिए आणविक लक्ष्यों की पहचान है । व?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778