Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Summary

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

Abstract

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti e fosforilano un stimato 8-13% del proteoma; Tuttavia, il numero degli obiettivi identificati per Cdk1, particolarmente in cellule umane è ancora basso. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto forniscono meccanicistici intuizioni come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è fondamentale per la segregazione del cromosoma fedele, e difetti in questo processo complicato portano ad aberrazioni cromosomiche e cancro.

Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che è utilizzata per identificare siti di fosforilazione Cdk1 specifici. In questo saggio, una proteina purificata è fosforilata in vitro di commercialmente disponibile umano Cdk1/ciclina B. Successful fosforilazione è confermata da SDS-PAGE, e siti di fosforilazione sono successivamente identificate mediante spettrometria di massa. Descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l'analisi della chinasi e un'analisi obbligatoria per la verifica funzionale dei siti di fosforilazione identificati, che l'interazione tra le sonde un segnale di localizzazione nucleare classica (cNLS) e relativo trasporto nucleare del ricevitore karyopherin α. Per aiutare con disegno sperimentale, passiamo in rassegna gli approcci per la stima dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici da sequenze proteiche. Insieme questi protocolli presentano un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi modello organismo e rendimenti risultati affidabili, specialmente se combinata con studi funzionali delle cellule.

Introduction

Le chinasi sono enzimi che regolano molti processi cellulari e trasferiscono gruppi fosfato da ATP su substrati. Questa fosforilazione è reversibile, veloce, aggiunge due cariche negative e memorizza l'energia libera ed è uno delle modificazioni post-traduzionali più comune usate dalle cellule. CDK1, che è anche conosciuto come omologo di proteina 2 ciclo di divisione cellulare (cdc2) è un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti^1,2,3,4,5e fosforila un orario 8-13% del proteoma

Protocol

1. previsione di siti di fosforilazione Cdk1 specifici dalla sequenza della proteina

1. Prima di iniziare l'analisi della chinasi, analizzare la sequenza della proteina per siti di fosforilazione Cdk1 specifici previsti e cercare la letteratura per i siti di fosforilazione sperimentalmente stabilito con specificità chinasi sconosciuto. Utilizzare i seguenti strumenti, banche dati e riferimenti che sono ricapitolati.
   1. Utilizzare il iGPS 3.0 software^{36,37<.......}

Discussion

La nostra analisi in vitro della chinasi sono un metodo molto potente per identificare bersagli molecolari per la chinasi Cdk1, che è un regolatore matrice del ciclo cellulare e regola molti processi cellulari importanti. Il metodo determina se una proteina purificata è un substrato per Cdk1 e permette l'identificazione di siti di fosforilazione specifici. Questo facilita gli studi meccanicistici per regolazione di processi cellulari da fosforilazione attraverso Cdk1.

Il fattore pi?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778