サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Summary

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1 と体外キナーゼ試金のためのプロトコルを紹介します。

Abstract

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) は、すべての真核生物の細胞周期のマスター コント ローラー; プロテオームの推定 8 ~ 13% を廃止ただし、ひと細胞で特に Cdk1 の特定のターゲットの数はまだ低いです。Cdk1 固有のリン酸化部位の同定は、機械論的洞察 Cdk1 が細胞周期を制御する方法を提供するように重要です。細胞周期制御は忠実な染色体分配に重要なこの複雑なプロセスの欠陥染色体異常やがんに 。

ここでは、Cdk1 のリン酸化サイトを識別するために使用される生体外でキナーゼ分析について述べる。このアッセイで浄化された蛋白質リン酸化培養では, SDS-PAGE による市販人間 Cdk1/サイクリン b. 成功によってリン酸化を確認し、質量分析法によるリン酸化のサイトの識別後。プローブ間の相互作用特定のリン酸化のサイトの機能の検証のキナーゼ試金および結合の試金の適切な高純度、均一なタンパク質製剤をもたらす浄化のプロトコルについても述べる古典的な核局在化信号 (cNLS) とその核輸送受容体 karyopherin α。実験計画を支援するためには、タンパク質から Cdk1 固有のリン酸化部位の予測のためのアプローチを確認します。一緒にこれらのプロトコルは Cdk1 のリン酸化サイトを生成でき、Cdk1 が細胞周期を制御する方法を解明する非常に強力なアプローチを提示します。このメソッドは浄化された蛋白質、細胞機能の研究と組み合わせる場合は特に任意モデル有機体そして利回り信頼性の高い結果に適用できます。

Introduction

キナーゼは、ATP からのリン酸基を基板に転送し、多くの細胞プロセスを調整する酵素です。このリン酸化は可逆的で、高速、2 つの負電荷を追加しますと自由エネルギーを格納、セルで使用される最も一般的な修飾の一つです。Cdk1 はまたとして知られている細胞分裂周期蛋白質 2 相同物 (cdc2) マスター コント ローラーではすべて真核生物^1,2,3,4、5、細胞周期では、廃止、プロテオーム^6、7の推定 8 ~ 13%。

一方、最近のプロテオミクス研究は、タンパク質においてはほとんどの場合、多くのリン酸化サイトを識別したキナーゼのこれらの変更のための責任は不明です。ヒトの細胞、特に、知られている Cdk1 ターゲット数は低⁷です。Cdk1 が細胞周期を制御する方法を確立する解明が可能、Cdk1 固有のリン酸化部位の同定が重要です。細胞周期制御は忠実な染色体分配と細胞分裂のために重要、無数の細胞プロ....

Protocol

1. タンパク質シーケンスから Cdk1 固有のリン酸化部位の予測

1. キナーゼ試金を開始、する前に予測 Cdk1 特定のリン酸化のサイトのために蛋白質順序を分析し、未知のキナーゼの特異性と確立された実験的リン酸化のサイトの文献を検索します。次のツール、データベース、および要約されている参照を使用します。
   1. Igp 3.0 ソフトウェア^36,37

Discussion

私たちの in vitroのキナーゼ試金は、細胞周期のマスター コント ローラーであり多くの重要な細胞プロセスを調整するキナーゼ Cdk1 のための分子ターゲットを識別するために非常に強力な方法です。浄化された蛋白質が Cdk1 の基板は、でき特定のリン酸化部位の同定であるかどうか、方法が決まります。Cdk1 による燐酸化によってこれを容易に解明の細胞プロセスの規則のため。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778